论文-董燕-怡瑞胶囊对高脂血症大鼠血清炎性因子及肝脏胆碱能受体a7表达的影响

怡瑞胶囊对高脂血症大鼠血清炎性因子及肝脏7nAChR表达的影响周海松1，易浪1，李文治2，罗其昌2，王青1，董燕作者简介：周海松 (1985- ) ，男，博士研究生， E-mail: 通讯作者：董燕（1969-），女，研究员，博士生导师； E-mail: *，王培训1（1. 广州中医药大学临床药理研究所, 510405广州；2. 无限极（中国）有限公司，529156江门） 摘要 目的：探讨高脂血症大鼠炎症水平与肝脏组织中烟碱型乙酰胆碱受体7表达的关系及怡瑞胶囊的干预作用。方法： SD雄性大鼠50只，随机分为正常组10 只，喂饲维持饲料；高脂饲料组40 只，喂饲高脂饲料，14d后再分为模型组和怡瑞胶囊低剂量组（140 mgkg-1）、中剂量组（280 mgkg-1）、高剂量组（560 mgkg-1），每组10只。灌胃给药30d，采血分离血清，检测血脂水平、ELISA检测C反应蛋白（CRP）和肿瘤坏死因子（TNF-）的水平，免疫组化、RT-PCR检测肝脏组织的7 nAChR的表达。结果：与正常组比较，高脂血症模型组大鼠血清中炎症因子CRP和TNF-含量显著升高（P0.01），肝脏中7 nAChR的mRNA表达水平升高（P0.01），与模型组比较，怡瑞胶囊各剂量组CRP和TNF-的水平显著降低（P0.01），肝脏组织中7 nAChR的mRNA表达水平显著降低（P0.01），7 nAChR表达的免疫组化分析结果与RT-PCR结果一致。结论：高脂血症大鼠肝脏组织中7nAChR的表达升高，怡瑞胶囊降低炎症水平和改善脂代谢的同时可下调7nAChR的表达。关键词 高脂血症；炎症；烟碱型乙酰胆碱受体；怡瑞胶囊；大鼠中图分类号:R285.5 文献标志码:A高脂血症是一种体内脂质代谢紊乱的疾病。肝脏是脂质和营养物质代谢和转化的主要场所，高脂血症易导致机体慢性炎症的长期存在，进而损害肝脏的正常生理功能1。肿瘤坏死因子（TNF-）和C反应蛋白（CRP）在机体对感染、损伤以及免疫应答中起重要作用，也是急、慢性炎症反应的主要介导因子2。7烟碱型乙酰胆碱受体（7 nAChR）是目前较明确的在胆碱能抗炎通路（cholinergic anti-inflammatory pathway，CAP）中发挥关键作用的受体，7 nAChR已成为炎症相关性疾病潜在的药物治疗靶标3。有研究报道活化CAP能改善肥胖诱导的炎症和胰岛素抵抗4，7 nAChR激动剂能降低糖尿病模型小鼠的体重并改善糖、脂代谢5。在脂多糖（LPS）刺激的巨噬细胞炎症模型中7 nAChR的表达升高6。而7 nAChR在肥胖、高脂血症模型动物中的表达变化尚未见报道。本研究采用高脂血症大鼠模型，给予怡瑞胶囊干预。实验中通过免疫组化及RT-PCR分析肝脏组织中7 nAChR蛋白及mRNA的表达，并观察高脂血症动物血清中血脂及促炎症因子肿瘤坏死因子（TNF-）、急性期蛋白C反应蛋白（CRP）的变化，初步探讨其7 nAChR在肝脏中的表达与高脂血症及炎症的相关性。1. 材料1.1 动物SD大鼠50只，SPF级，平均体重质量（15020）g，雄性，由广东省医学实验动物中心提供，合格证号SCXK（粤）2008-0002，饲养于广州中医药大学动物中心SPF级动物房。1.2 药物及相关试剂怡瑞胶囊，由丹参、山楂、泽泻、紫苏子油微囊、三七粉、银杏叶的提取物组成，由无限极（中国）有限公司提供 （批号13H21A01A）； 称取胶囊内容物适量，以生理盐水配制成适当浓度的混悬液，4保存备用。高脂饲料由广东省医学实验动物中心加工生产 （批号20131126）。配方20.0蔗糖，15猪油，1.2胆固醇，0.2胆酸钠，10%酪蛋白，0.6%磷酸氢钙，0.4%石粉，52.6%维持饲料配制。总胆固醇（TC）检测试剂盒 （批号2013100036）,甘油三酯（TG）检测试剂盒 （批号2013100024）,低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）检测试剂盒 （批号20130722）,高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）检测试剂盒 （批号2013080020）（均购自南京建成生物工程研究所），TNF- ELISA检测试剂盒 （批号 E09483-1660）（购自美国eBioscience公司），C反应蛋白（CRP）ELISA检测试剂盒 （批号：CK-E30459R）（购自中国卡尔文生物科技有限公司），7 nAChR山羊多抗（编号：sc-1447）（购自美国Santa Cruz Biotechnology公司），多聚体抗山羊IgG-HRP两步法组化试剂盒（货号：SV0003）（购自武汉博士德生物工程有限公司），DAB显色试剂盒 （批号:DAB-0031/1031）购自福州迈新生物技术开发有限公司。1.3 仪器 Centrifuge 5810R 型台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司），Synergy HT型多功能酶标仪（美国Bio Tek公司），微量加样器（法国吉尔森公司），PE-9600型PCR仪（Singapore公司），DYY-6C型电泳仪（北京六一仪器厂），Tanon-1600型凝胶图像分析系统（上海天能科技有限公司），DU series 700型紫外-可见光分光光度计（Beckman Coulter公司），80i 正置荧光显微镜 （日本NIKON公司）。2 方法2.1 动物分组及造模给药适应性饲养1周后，按体重随机分成2组，空白对照组10只，给予维持饲料，高脂饲料组40只，给予高脂饲料。2周后，空白对照组和高脂饲料组大鼠不禁食采血，采血后分离血清，测定血清TC，TG，LDL-C ，HDL-C水平。根据TC水平将高脂饲料组大鼠随机分成4组，每组10只。分别为模型对照组，怡瑞胶囊低、中、高剂量给药组，分组后各组间比较TC，TG，LDL-C，HDL-C数值差异均无显著性。 分组后，给药组按低、中、高（140, 280, 560 mgkg-1）3个剂量每天经口灌胃给药。怡瑞胶囊成人每天的服用量为1400 mg，低剂量组是按照人、大鼠等效剂量换算后的剂量；空白组和模型组同时给予同体积的生理盐水；空白组继续给予维持饲料，模型组及给药组继续给予高脂饲料。2.2 取材于给药30 d后不禁食经眼眶静脉丛采血后，脱颈椎处死，取肝脏于生理盐水中洗净残血，滤纸吸干水分，锡纸包好后，放入于-80冰柜中冻存备用。2.3 血清中TC，TG，LDL-C，HDL-C水平的检测采血后尽快分离血清，按试剂盒说明书步骤操作，经酶标仪测定各孔吸光度值，按公式计算含量，测得血清中TC，TG，LDL-C，HDL-C水平。2.4 血清中TNF-，CRP含量的检测取血清，按ELISA试剂盒说明书步骤操作，经酶标仪测定各孔吸光度值，按公式计算含量，测定血清中 TNF-，CRP含量。2.5 免疫组化法检测肝脏中7 nAChR蛋白的表达7 nAChR染色：常规石蜡切片脱蜡至水化，滴加3%的过氧化氢溶液10min灭活内源性酶，蒸馏水漂洗3次后，切片浸入0.01M的枸橼酸盐缓冲液（PH=6.0）中进行热抗原修复。PBS洗涤两遍后，滴加5%BSA封闭液（试剂盒内附），室温封闭30min，甩去多余液体，不洗。加入稀释后的7nACHR抗体（1:100），湿盒中4过夜，PBS漂洗3次后，滴加聚合 HRP 标记抗羊 IgG， 37孵育 30 min，PBS漂洗3 次后，按说明书要求室温进行DAB显色，可通过显微镜观察控制反应时间，蒸馏水洗涤10min后，苏木素复染，1%盐酸酒精中分化，氨水显蓝，依次通过75%、85%、95%、100%乙醇梯度脱水。通过苯酚-二甲苯溶液和进行透明后，通风处吹干。中性树脂封片，晾干，Nikon显微镜下观察拍照。作为模型组阴性对照，是取模型组切片，除将一抗替换为PBS外，均与上述免疫组化操作步奏一致。组织细胞中出现黄色至棕褐色颗粒为阳性反应判定标准。2.6 RT-PCR法检测肝脏中7 nACh受体 mRNA的表达按Trizol说明书，提取RNA，进行逆转录合成cDNA，再以cDNA为模板进行扩增。PCR反应中Taq PCR Master-Mix 12.5 L，上游及下游引物（10 mol.L-1）各1 L，cDNA模板2.5 L，补充双蒸水至总体积25L，7nAChR扩增条件为：95 3 min预热，94 30 s变性，60 30 s退火，72 1min延伸，40个循环后，72 延伸5 min。-actin扩增条件：94 4 min预热，95 30 s变性，55 30 s退火，72 1 min延伸，40个循环后，72 延伸5 min。产物经电泳及使用凝胶分析仪配套软件对电泳谱带进行分析，以-actin为内参，用相对值（7nAChR /-actin）表示各实验组mRNA水平。目的及内参基因PCR引物序列信息见表1。表1 PCR引物序列Table 1 PCR primers sequences引物名称引物序列扩增片段长度/bp7 nAChRForward: 5-ATCTGGGCATTGCCAGTATC-3199Reverse: 5-TCCCATGAGATCCCATTCTC-3-actinForward: 5-ATATCGCTGCGCTGGTCGTC-3517Reverse: 5- AGGATGGCGTGAGGGAGAGC-32. 7 数据处理与统计分析全部数据用SPSS15.0统计分析软件进行处理分析，结果以均数标准差()表示。模型组与正常对照组间均值差异的显著性检验采用独立样本T检验，给药组各组间均值差异的显著性检验方法采用单因素方差分析(ANOVA)进行处理，显著性水平取P=0.05。3. 结果3.1高脂血症动物模型的建立从表2可见，模型组大鼠高脂饮食44天时，其血清中TC，TG以及LDL-C均显著高于对照组（P0.05），有统计学意义，表明高脂血症模型建立成功。3.2 怡瑞胶囊对血清中TC，TG，LDL-C，HDL-C的影响从表2可见，与模型组比较，怡瑞胶囊中、高剂量组的血清TG降低，血清TC或LDL-C降低，且差异均有显著性（P0.05），同时各剂量组血清HDL-C不显著低于模型组，根据保健品功能评价规范可判定该制剂辅助降低血脂功能动物实验结果呈阳性7-8。表2 怡瑞胶囊对高脂血症大鼠血清血脂水平的影响(,n=10)Table 2 Effects of Yirui capsule on Serum blood lipid levels in hyperlipidemia rats 组 别剂量 /mgkg-1TC/mmolL-1TG/mmolL-1LDL-C/mmolL-1HDL-C/mmolL-1空白对照-1.550.151.310.240.410.081.07 0.08模型- 3.270.581) 3.031.091) 1.130.441) 0.90 0.091)怡瑞胶囊1402.710.232.310.731.090.40 1.80 0.162)280 2.580.352) 1.390.312)0.980.330.85 0.065602.770.39 1.980.652) 0.310.252)0.96 0.09注：与空白组比较1)P0.05; 与模型组比较2) P0.05。3.3怡瑞胶囊对血清中TNF-、CRP水平的影响从表3可见，与空白组比较，模型组血清中炎性因子TNF-、CRP水平明显上升，差异均有显著性（P0.01）。与模型组比较，怡瑞胶囊各剂量组血清内炎性因子TNF-、CRP水平均降低，差异均有显著性（P0.01），但仍高于正常组（P0.01），表明该制剂能一定程度上改善高脂血症大鼠的炎症状态。表3 怡瑞胶囊对高脂血症大鼠血清中TNF-和CRP水平的影响（,n=10）Table 3 Effects of Yirui capsule on serum TNF- and CRP levels in hyperlipidemia rats 组 别剂量 (mgkg-1)TNF- （ngL-1）CRP （mgL-1）空白-14.610.321.370.05模型- 17.380.991)1.630.031)怡瑞胶囊140 15.890.732)1.530.022)280 15.720.712)1.520.022)560 15.170.502)1.510.052)注：与空白组比较1)P0.01; 与模型组比较2) P0.01。3.4怡瑞胶囊对大鼠肝脏中7 nAChR表达的影响显微镜下观察免疫组化染色切片( 见图 1) ，正常组（图1-A）无明显棕黄色阳性着色点，模型组（图1-B）可见明显棕黄色阳性着色点，怡瑞胶囊组(图1- C)可见少量黄色、浅黄色着色，与模型组相比颜色较淡。模型组阴性染色对照 (图1-D)中无明显棕黄色阳性着色点。图1大鼠肝脏中7 nAChR的表达（免疫组化染色，200X）Figure 1 Expression of 7nAChR expression in the rats livers (immunohistochemical staining, x200)A, 空白对照组；B, 模型组；C, 怡瑞胶囊（280 mgkg-1）组；D，模型组阴性染色对照3.5 怡瑞胶囊对高脂血症大鼠肝脏中7 nAChR的mRNA表达的影响采 高于han A. 用RT - PCR分析空白对照组、模型组、怡瑞胶囊（280 mgkg-1）组大鼠肝脏组织7 nAChR 基因的表达变化，7 nAChR的 RT - PCR产物电泳结果显示扩增片段与Marker比较后，与预期199bp相符（图2）。空白组大鼠肝脏组织中7 nAChR受体的mRNA 表达量较低，模型组7 nAChR mRNA的相对表达水平较正常组升高，有显著性差异（P 0. 01）；怡瑞胶囊（280 mgkg-1）组肝脏组织中7 nAChR mRNA表达明显降低，对比模型组有显著性差异（P0.01）（表4）。 1,2,3为空白对照组、模型组、怡瑞胶囊（280 mgkg-1）组7nAChR mRNA的RT-PCR产物，4,5,6为空白对照组、模型组、怡瑞胶囊（280 mgkg-1）组内参（-actin）的RT-PCR产物图2大鼠肝脏7nAChR mRNA表达Figure 2 Expression of 7nAChR mRNA in the rats livers by RT-PCR表4 大鼠肝脏中7nAChR mRNA的RT-PCR产物分析（，n=5）Table 4 Analysis of RT-PCR production of 7nAChR mRNA in the rats livers组 别剂量 (mgkg-1)7nAChR/-actin空白-0.610.03模型-0.820.041)怡瑞胶囊组2800.740.042)注：与空白组比较1)P0.01; 与模型组比较2) P0.01。4. 讨论：CRP是机体的一种重要急性期蛋白，由肝脏合成并释放入血，能介导炎症和促进炎症反应的发生，是动脉粥样硬化的重要危险因子9。CRP已被确认是糖尿病心血管事件的独立预测因子，其升高与糖尿病心血管事件密切相关10。本研究表明怡瑞胶囊各剂量组均能降低高脂血症大鼠血清中升高的CRP水平。TNF-主要由单核/巨噬细胞产生，它在局部脂肪组织中的表达与肥胖程度有一定正相关，可介导肝细胞损伤并参与肝脏炎症及纤维化进展。本实验中高脂血症大鼠血清TNF-升高，怡瑞胶囊各剂量组均能降低TNF-水平。近年围绕胆碱能抗炎通路（CAP）的研究取得一些进展。CAP是指机体内的迷走神经兴奋释放的递质乙酰胆碱（Acetylcholine，ACh）或者拟胆碱药物如烟碱等作用于免疫细胞表面的胆碱能受体发挥免疫调节作用。活化CAP能够抑制网状内皮系统内巨噬细胞释放TNF-并且能够阻止全身TNF-的异常升高。烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptor，nAChR）属于配体门控的离子通道受体家族，主要分布在迷走神经的效应器上，也分布于多种免疫细胞表面，近年也发现其在多种组织细胞表面、肿瘤细胞表面表达。7 nAChR是目前较明确的在CAP中发挥关键作用的受体，作用于7 nAChR的激动剂如烟碱等对多种炎性相关性疾病动物模型具有治疗作用，如对脓毒症、类风湿性关节炎、炎症性肠病、肥胖与胰岛素抵抗等均表现抗炎和治疗作用4。已报道降血脂中药能降低机体炎症水平，但对肝脏7 nAChR的影响尚未见报道。对高脂血症大鼠肝脏7 nAChR的分析发现，高脂饮食提高TC、TG、LDL-C、HDL-C水平、升高炎性因子的同时，肝脏7 nAChR表达升高，怡瑞胶囊能改善炎症状态，并降低7 nAChR的表达水平。研究提示7 nAChR可能是中药改善高脂饮食所致代谢性疾病的潜在治疗靶点。参考文献1 张晋岳. 脂可清胶囊对高脂血症患者血液炎症因子的影响J. 中国实验方剂学杂志, 2013, 19(6): 333-335.2 Wu Z, Kong X, Zhang T, et al. Pseudoephedrine/ephedrine shows potent anti-inflammatory activity against TNF-mediated acute liver failure induced by lip polysaccharide/d-galactosamine J. Eur J Pharmacol, 2014, 724:112-121.3 罗进芳, 董燕, 易浪, 等. 胆碱能抗炎通路及其在中医药抗炎免疫研究中的进展J.中药新药与临床药理, 2014, 25(6): 760-765.4 Wang X, Yang Zh, Xue B, et al. Activation of the Cholinergic Antiinflammatory Pathway Ameliorates Obesity-Induced Inflammation and Insulin Resistance J. Endocr