针药结合对乳腺增生大鼠血清及乳腺vegfbfgf含量的影响课件

针药结合对乳腺增生大鼠血清及针药结合对乳腺增生大鼠血清及 乳腺乳腺VEGFVEGF、bFGFbFGF的影响的影响 河北医科大学河北医科大学 杜惠兰杜惠兰 靳亚慈靳亚慈 F乳腺增生病育龄期妇女的常见病，多发病 F发病率占全部乳房疾病的74.1%，且有逐年上 升的趋势 F患病人群乳腺癌发生率较普通人群高23倍 F因此,积极治疗乳腺增生病，对预防其发生癌 变、提高妇女生活质量具有重要意义。 目前，西医对本病尚缺乏令 人满意的治疗措施，其内分泌疗 法副作用较大，长期使用可干扰 体内激素的平衡，不宜作为常规 用药。 乳腺增生病属于中医“乳中结核”、“乳疬”等范畴 中医治疗乳腺增生病积累了大量的临床经验 单纯服用中药 单纯应用针灸 如何进一步提高疗效，缩短疗程，成为研究重点 中药和针灸作为中医学的两大疗法，经曰：“汤药攻 其内，针灸攻其外，则病无所逃矣”。两者各有长 短，合用则相得益彰。 F乳腺增生病在病理方面除了表现在上皮细胞、 间质细胞、腺泡、导管等组织的增生外，亦存 在着血管的增生。 F目前血管内皮生长因子（VEGF）和碱性成纤维 细胞生成因子（bFGF）被认为是乳腺癌特异性 最强的两种血管因子。 F推测乳腺增生中血管的生成可能与VEGF和 bFGF密切相关。 因此，我们采用肌注外源性激素的方法复 制乳腺增生大鼠模型，应用放免和免疫组织化 学技术探讨乳腺增生病变与血清、乳腺VEGF 和bFGF的关系以及针药协同作用对血清、乳 腺VEGF和bFGF的调节治疗机制。 材料与方法材料与方法 动物：清洁级雌性Wistar大鼠60只，7585日龄，22020g由 河北医科大学实验动物中心提供，合格证号：602089 药物和试验试剂 中药(柴胡、郁金、川楝子、王不留行、荔枝核、山慈菇 等)采用传统煎煮方法，过滤，离心，浓缩制成水煎液， 含生药2.75g/ml，密封分装，4放置备用 苯甲酸雌二醇、黄体酮均由天津金耀氨基酸有限公司生产 枸橼酸他莫昔芬（ TAM ）由上海医药集团有限公司华联 制药厂生产 VEGF和bFGF酶联免疫试剂盒，购于美国R-D公司。E2、 P放免试剂盒购于美国DSL公司。PRL放免试剂盒购于天 津九鼎医学生物工程有限公司。 动物分组动物分组 大鼠适应性喂养2周后，按随机数字表法将 其分为6组，每组10只： 正常组 模型组 模型+针刺组（简称“针刺组”） 模型+中药组（简称“中药组”） 模型+针刺+中药组（简称“针药组”） 模型+TAM阳性对照组（简称“对照组”） 复制模型复制模型 正常组大鼠常规喂养 其余组参照张璐2等造模方法，大鼠腹腔注 射苯甲酸雌二醇0.5mg/kg/日，连续25天，然 后注射黄体酮5mg/kg/日，连续5天，建立大 鼠乳腺增生模型。 治疗方法治疗方法 从第31天开始，各组分别治疗: 针刺组：根据中国兽医针灸学结合人体穴位，选 取屋翳、合谷、膻中、足三里，每日1次，9 次为一疗程，疗程间休息1天，共30日。 中药组：按25g/kg/日灌服中药，30日。 针药组：针刺操作同针刺组，同时灌服中药，剂量同 中药组，30日。 对照组：三苯氧胺1.8mg/kg/日，相当于临床等效剂 量，30日。 正常组和模型组：灌服同体积蒸馏水，30日。 标本制备和检测方法标本制备和检测方法 末次治疗5小时后，用游标卡尺测量第2对乳房的直径。 断头取血，制备血清，置-70保存，用放免法测定血清 E2、P和PRL含量，酶免法测定血清VEGF和bFGF含量。 切取第2对乳房，甲醛固定，常规石蜡包埋切片，免疫组 化染色。 美国IPP分析软件对免疫组化染色切片进行图像分析，每 个切片采集5个视野，得出度量物质含量信息的灰度等级 ，将所得灰度值取平均数作为统计指标。 平均灰度与阳性表达强弱成反比，灰度值越小，阳性染 色越强，蛋白表达越多。 统计方法统计方法 所有数据用均数标准差表示 用SPSS12.0统计软件进行统计处理，对所 测定结果进行正态性及方差齐性检验，组 间比较用单因素方差分析 检验以P0.05为有统计学意义 动物一般状况 F正常组：大鼠毛色白而光泽，精神佳，反应灵敏 ，饮食、二便正常，乳房大小正常，色淡红，质 软，用棉签触压时大鼠无明显的痛苦感。 F模型组：大鼠乳房乳头增大，色鲜红，质硬，用 棉签触压时大鼠出现明显的痛苦感，易激惹。 结结 果果 大鼠乳头直径的变化 大鼠血清生殖激素的变化 血清VEGF的变化 血清bFGF的变化 乳腺组织VEGF、bFGF的表达 VEGF、bFGF的阳性表达定位于细胞浆内，为棕黄色 染色。 与正常组相比，模型组大鼠乳腺组织中VEGF、bFGF 的表达增强（P0.01）。 治疗后，针刺组、中药组和针药组VEGF、bFGF的表 达均明显低于模型组（均P0.01）； 对照组与模型组比较有降低的趋势，但两组之间比较 无统计学意义（P0.05）。 针刺组VEGF表达 正常组VEGF表达 模型组VEGF表达中药组VEGF表达 针药组 VEGF表达对照组VEGF表达 各组各组VEGFVEGF的表达的表达 正常组bFGF表达模型组bFGF表达中药组bFGF表 达 各组各组bFGFbFGF表达表达 针刺组bFGF表达针药组 bFGF表达 对照组bFGF表 达 讨讨 论论 乳腺增生大鼠模型的复制 F造模方法 肌注外源性激素 摘除双侧卵巢 多数学者认为，乳腺增生病的发生与内分泌紊 乱、卵巢功能失调造成体内长时间的P不足、 E2绝对或相对增多有关。 乳腺增生病被认为是乳腺癌癌前的一种良性病 变，在病理方面除了表现在上皮细胞、间质细 胞、腺泡、导管等组织的增生外，亦存在着血 管的增生。血管增生在乳腺肿瘤的生长过程中 起到了重要作用。 VEGF在健康成人组织中维持正常的血管密度和基本的 渗透功能，以利于营养物质的运输，但表达水平极低 ，是机体内皮细胞特异性的分裂原和血管增生因子， 对血管生成和血管通透性增加有重要的调节功能 VEGF通过刺激血管新生促进肿瘤细胞的生长和转移， 是目前所知的作用最强，选择性最高的内皮细胞丝裂 原，是肿瘤血管生成过程中的重要调节因子。 VEGF及其受体通过旁分泌途径联合调控内皮细胞分化 、血管生成；又通过自分泌调节功能协调其功能的完 成。 在血管形成的调控中，bFGF起着关键作用。 bFGF能促进表皮、内皮细胞再生，促进血管内皮细胞 分裂，诱导其从基膜中分离出来，以刺激内皮细胞向 肿瘤组织趋化运动，并形成管状结构，还可提高组织 中血纤维蛋白溶解酶原激活因子类(PAs)，诱导内皮细 胞产生其他蛋白酶，是血管形成较为直接的诱导物质 bFGF亦能通过自分泌和旁分泌形式促进肿瘤的生长与 转移。 中医认为，本病病因在肝，病位在乳，病机为 肝气郁结，气结而血凝，血凝而瘀滞，久而成 块，发为乳癖。 治疗大法：疏肝理气、活血化瘀、软坚散结， 同时调畅与乳房疾病关系密切的肝、胃、冲、 任经脉，针药结合，达到治疗目的。 中药方解 柴胡条达肝气，丹参活血通经，祛瘀止痛； 川楝子、王不留行、丹皮、郁金等行气清气、 活血和血； 荔枝核、山慈菇、夏枯草、牡蛎等软坚散结， 去乳癖病之标邪。 全方共收疏肝理气、活血化瘀、软坚散结之 功效，使痰瘀等已成之邪速化，气血运行畅通 ，恢复正常生理功能。 针刺选穴 膻中：为气之会，以调理全身之气； 屋翳：足阳明胃经之穴，直接作用于乳房，疏 通局部经络，调和冲任两脉； 配合谷疏肝理气、足三里健运脾胃以运湿化痰 诸穴合用，畅达阳明经气而达消肿散 结止痛之目的。 在乳腺增生模型大鼠的血清中，存在着VEGF和 bFGF的高含量，在局部组织中存在着VEGF和 bFGF的高表达，我们认为在乳腺增生模型大鼠 中存在着血管增生，乳房局部已经存在微循环障 碍。 VEGF和bFGF可能通过一定的途径被激活后，通 过某种共同的机制促使乳腺组织局部的增生。 针药结合可能通过下调VEGF和bFGF，减少病变 区域的血流信号，加快血