医学类乙型肝炎病毒的异质性课件

乙型肝炎病毒的异质性乙型肝炎病毒的异质性 及临床意义及临床意义 北京地坛医院北京地坛医院 HBV的感染过程 第一部分第一部分 乙型肝炎病毒的血清型乙型肝炎病毒的血清型 1 1 决定因素决定因素 乙型肝炎病毒的血清型，由膜主蛋白序列来决定。乙型肝炎病毒的血清型，由膜主蛋白序列来决定。 2 2 亲水结构区亲水结构区 HBsAgHBsAg有两个亲水区：有两个亲水区：32-76 32-76 aaaa和和110-156 110-156 aaaa。HBsAgHBsAg亲水赖亲水赖 氨酸改变，抗原活性消失。氨酸改变，抗原活性消失。 3 3 共同决定簇共同决定簇 139-147 139-147 aaaa是共同簇抗原是共同簇抗原a a必需的最小序列。必需的最小序列。 乙型肝炎病毒的血清学分型乙型肝炎病毒的血清学分型 1 1 排斥决定簇排斥决定簇 主蛋白还携带两对相互排斥的亚型决定簇主蛋白还携带两对相互排斥的亚型决定簇d/y d/y （122-134 122-134 aaaa指令指令d/yd/y决定决定 簇）和簇）和w/r w/r （159-160 159-160 aaaa指令指令w/rw/r决定簇）。决定簇）。 2 2 四个主要亚型四个主要亚型 组成组成4 4个主要亚型：个主要亚型：adwadw、adradr、aywayw和和ayrayr。 四个主要亚型四个主要亚型 除了除了4 4个主要亚型外，还有个主要亚型外，还有adyradyr、 adwradwr、adyw/aywradyw/aywr和和adywradywr等复合亚型。不等复合亚型。不 同亚型在外膜蛋白的前同亚型在外膜蛋白的前-S-S区序列和全基因组区序列和全基因组 序列亦有相应的差异。序列亦有相应的差异。 复合亚型复合亚型 第二部分第二部分 乙型肝炎病毒的基因型乙型肝炎病毒的基因型 HBV基因型的定义 分型方法是根据HBsAg主蛋白基因或全基 因组核苷酸序列差异性进行的基因型分型 ，差异大于8%即被确定为另一基因型，按 照这种分型方法，将HBV分为6种基因型， 分别命名为A-F型，另有学者新定义了G、 H型，尚待确定。 国内流行病学资料 国内主要的基因型为B、C两型，台湾 省的研究资料提示除E型外，其他基因 型均可在华人HBV感染者中检出，B和 C型占患者人群的85%。 HBV 的异质性 基因型 基因型基因型 * * 地理分布地理分布 A A 北欧、西欧、美国、非洲北欧、西欧、美国、非洲 B B 中国、印度尼西亚、越南中国、印度尼西亚、越南 C C 中国、越南、朝鲜、日本中国、越南、朝鲜、日本 D D 地中海区、中东、印度地中海区、中东、印度 E E 西非西非 F F 美国（印地安拿人）、波利尼西亚美国（印地安拿人）、波利尼西亚 G G 欧洲、美国欧洲、美国 * * 根据根据 HBV HBV 全序列中核苷酸差异全序列中核苷酸差异 8%8% Chu CJ et al. Hepatology 2002; 35(5):1274 第三部分第三部分 乙型肝炎病毒基因准种的特点乙型肝炎病毒基因准种的特点 问问 题题 不同的慢性乙型肝炎患者之间血清中乙型肝炎病毒基因不同的慢性乙型肝炎患者之间血清中乙型肝炎病毒基因 序列是不同的，因此可以根据序列的差别分成不同的血清型序列是不同的，因此可以根据序列的差别分成不同的血清型 （adradr、aywayw、adwadw 等等），也可以分成不同的基因型（，也可以分成不同的基因型（A A、B B、C C 、D D、E E、F F、GG、H H）。）。 问：同一个患者血液中不同的乙型肝问：同一个患者血液中不同的乙型肝 炎病毒之间其基因序列是否相同？炎病毒之间其基因序列是否相同？ 答：相同！或答：相同！或 不同！不同！ 型与准种 基因型 （不同个体之间） 血清型 （不同个体之间） 准 种 （单一个体） 乙型肝炎病毒准种的定义乙型肝炎病毒准种的定义 乙型肝炎病毒在长期复制过程中，由于逆转录过程其多乙型肝炎病毒在长期复制过程中，由于逆转录过程其多 聚酶缺乏严格的校正机制，从而产生自发点突变，造成子代聚酶缺乏严格的校正机制，从而产生自发点突变，造成子代 病毒基因序列之间的微小差别，因而血清中的乙型肝炎病毒病毒基因序列之间的微小差别，因而血清中的乙型肝炎病毒 基因序列是不同的。这种差别一般小于全长基因组的基因序列是不同的。这种差别一般小于全长基因组的5%5%。 有微小基因序列有微小基因序列差别差别、但序列十分、但序列十分相近相近的乙型肝炎病毒的乙型肝炎病毒 组成的组成的病毒群病毒群，这一病毒群时刻处于，这一病毒群时刻处于动态变化动态变化之中，乙型肝之中，乙型肝 炎病毒的这种存在状态称为炎病毒的这种存在状态称为“ “准种准种” ”。 英文：英文：quasispeciesquasispecies 为什么以前没有注意？ 方法比较 既往方案： 收集血清 提取血清中HBV DNA 设计重叠PCR引物 PCR扩增 产物直接测序 （单一克隆序列） 本研究方案 收集血清 提取血清中HBV DNA 设计PCR引物 PCR扩增 TA克隆入质粒载体中 随机选择单克隆测序 （多个克隆序列） S S 基因准种的特点基因准种的特点 （前（前- -S1S1、前、前- -S2S2、S S） Protocol of Human Somatic Gene Therapy S 基因全长 PCR, 1400 bp 1 2 3 4 M 5 6 7 1 400 bp HBV全S基因RFLP结果 随致病菌的种类、数量、毒力以及患儿年龄和抵抗力的强弱不同而异。轻者仅有一般感染症状，重者可发生感染性休克、DIC、多器官功能衰竭 等。侵入人体的细菌是否会引起败血症，与入侵菌的毒力、数量和人体防御免疫功能有密切联系。 引起败血症的金黄色葡萄球菌 下这些都可能导致败血病的发生：皮肤、粘膜发生破损和发炎如创伤和伤口感染、大面积烧伤、开放性骨折、疖、痈、感染性腹泻、化脓性腹膜 大量进入血循环。大面积烧伤患者的广大创面为细菌入侵敞开门户，皮肤坏死、血浆渗出、焦痂形成又为细菌繁殖创造良好环境。 13 致病 菌的变迁及常见的败血症致病菌：具有致病性或条件致病性的各种细菌均可成为败血症的病原体。由于年代的不同，患者的基础疾病不同，传入 途径以及年龄段不同等因素的影响，致败血症的细菌也不同。1950 年以前，败血症的病原菌主要是溶血性链球菌和肺炎球菌，占总数的50%以上 ，葡萄球菌（金葡+表葡）占20%，革兰阴性杆菌占12%左右。随着广谱抗生素、皮质激素和免疫抑制剂的广泛应用，败血症的病原菌谱也发生了 变迁。由于溶血性链球菌和肺炎球菌对青霉素等高度敏感，作为败血症的病原现已少见。近年来统计，厌氧菌占败血症病原8%26%不等（较多 医院不能做厌氧菌检测），以脆弱类杆菌和消化链球菌为主。在机体防御功能显著低下者中还可发生复数菌败血症，即在同一份标本中检测出2种 或更多种致病菌，或72h内从数次血或骨髓标本中培养出多种致病菌。一般复数菌败血症约占败血症总数的10%。 精品PPT课件 浏览免费 下载后可以编辑修改。 /xmlxh /jnlxh / / / 课件下载后可以编辑，欢迎下载收藏。 遗传树分析 E853-A3 E845-A12 E845-B4 E845-A16 E845-A8 Renbao Gan N19 E5 N19 A3 N19 A8 N19 E19 EJ1 B13 EJ1 A4 E67 B5 E67 A1 E67 A8E67 B1 E67 B8 N19 E5 EJ1 B6 EJ1 A12 EJ1 B16 HBV准种特点分析 HBV DNA S Region HBV DNA X Region HBV DNA P Region HBV DNA C Region HBV DNA Pre-C 区 HBV DNA 全长 HBV DNA 基因准种的基因准种的 个体化特点个体化特点 HBsAg氨基酸序列 RT702 A3 MENTT-LFGGA-VPFAQWFAG- RT702A14 MENTT-LFGGA-VPFAQWFAG- RT702 B3 MENTT-LFGGA-VPFAQWFAG- RT702A10 MENTT-LFGGA-VPFAQWFAG- RT522 B7 MESTT-LFGGA-VPFVQWFVG- RT522 A5 MESTT-LFGGA-VPFVQWFVG- RT522B11 MESTT-LFGGA-VPFVQWFVG- RT XJ A2 MENTT-LFGEA-VPFVQWFVG- RT XJ A6 MENTT-LFGEA-VPFVQ*FVG- RT XJ B5 MENTT-LFGEA-VPFVQWFVG- RT XJ C4 MENTT-LFGEA-VPFVQWFVG- 变异的一些特点（逆转录酶区） RT702 A3 -SSNLSWLS-SHPIVLGF-VIGSWGTLPQEHIVLKIK- RT702A14 -SSNLSWLS-SHPIVLGF-VIGSWGTLPQEHIVLKIK- RT702 B3 -SSNLSWLS-SHPIVLGF-VIGSWGTLPQEHIVLKIK- RT702A10 -SSNLSWLS-SHPIVLGF-VIGSWGTLPQEHIVLKIK- RT522 B7 -SSNLTWLS-SHPIILGF-VIGSWGTLPQEHIVLKLK- RT522 A5 -SSNLTWLS-SHPIILGF-VIGSWGTLPQEHIVLKLK- RT522B11 -SSNLTWLS-SHPIILGF-VIGSWGTLPQEHIVLKLK- RT XJ A2 -SSNLSWLS-SHPIILGF-VIGCWGTLPQEHIVLKIK- RT XJ A6 -SSNLSWLS-SHPIILGF-VIGCWGTLPQEHIVLKIK- RT XJ B5 -SSNLSWLS-SHPIILGF-VIGCWGTLPQEHIVLKIK- RT XJ C4 -SSNLSWLS-SHPIILGF-VIGCWGTLPQEHIVLKIK- 前前- -S2S2基因基因 缺失突变的研究缺失突变的研究 线线 索：索： S S 基因研究中发现前基因研究中发现前- -S2S2区多个缺失突区多个缺失突 变株的存在变株的存在 HBV在慢性患者人群中的准种现象 前-S2区缺失突变分析 总数 无缺失 缺失百分比 HBeAg 阳性 36 23 13（36% ） 抗-HBe 阳性 15 1 14（93% ） 合计 51 24 27（ 52%） 前-S2区缺失突变位点分析 位点 范围 702-4 nt 43-66 24 bp ZH-A6 nt 52-66 15 bp ZH-B4 nt 37-66 30 bp ZH-B12 nt 37-66 30 bp N314-5 nt 25-66 42 bp N314-7 nt 25-66 42 bp 811-B12 nt 52-66 15 bp 不同病毒株突变位点 adr MQWNSTTFHQALLDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPVPTTASPISSIFSRTGDPAPN 702-1 -A-I-H 702-4 -A-I- 702-9 -G-A-T-I- 702-10 -G-A-T-I- 314-1 -T-Q-L-I- 314-5 -L- 314-7 -L- 314-9 -T-Q- ZH-A6 -Q- ZH-B4 - ZH-B6 - ZH-B11 - ZH-B12 - 142-A3 - 142-A7 - 142-A8 -H 811-A7 - 811-A8 - 811-B12 - 本研究的一些重要发现 慢性乙肝患者体内存在有HBV准种群。 HBV准种群中存有缺陷型病毒，即部分ORF编 码序列经突变终止了正常表达。 前C/C区、X区、前-S2区内部存有缺失突变 ，尤其以后2个区域多见。 HBV变异存在个体化现象。 血液中发现了截短型表面抗原中蛋白 关于准种研究的一些问题 乙型肝炎病毒的高变区与高保守区的界定？ 乙型肝炎病毒准种与感染慢性化的关系？ 乙型肝炎病毒准种群的漂变规律与肝纤维化的关系？ 乙型肝炎病毒准种群的漂变规律与肝细胞癌的关系？ 干扰素治疗与乙型肝炎病毒准种群的漂变？ 拉米夫定治疗与乙型肝炎病毒准种群的漂变？ 耐药株与准种漂变规律的关系？ 需要多靶位的“联合、序贯”的治疗？ 乙型肝炎病毒研究的乙型肝炎病毒研究的 临床意义临床意义 第第 一一 首先是改变了我们既往对乙型首先是改变了我们既往对乙型 肝炎病毒存在状态的看法。肝炎病毒存在状态的看法。 概念：概念： 1 1 差别，差别，2 2 相似，相似， 3 3 种群，种群，4 4 动态。动态。 第第 二二 提高了我们的科研设计水平，提高了我们的科研设计水平， 以及学术论文的鉴赏水平。以及学术论文的鉴赏水平。 治疗前后比较治疗前后比较 病情变化前后比较病情变化前后比较 印度寓言：盲人摸象印度寓言：盲人摸象 第第 三三 提高了我们对于乙型肝炎病毒提高了我们对于乙型肝炎病毒 标准株或参考株的判断水平。标准株或参考株的判断水平。 早期克隆的病毒株早期克隆的病毒株为标准为标准序列？序列？ ConsensusConsensus序列为标准序列？序列为标准序列？ 第第 四四 有利于深入、正确认识拉米夫有利于深入、正确认识拉米夫 定用药过程中定用药过程中YMDDYMDD变异等问题。变异等问题。 是药物选择的结果，不是诱导的结果。是药物选择的结果，不是诱导的结果。 拉米夫定对野生型HBV的抑制 核苷类似物 拉米夫定 ss (-) DNA 抑制 HBV 聚合酶 (野生型) 高亲和力 M D Y D Y = 酪氨酸 M = 蛋氨酸 D = 天门冬氨酸 拉米夫定和 YMDD 变异株HBV Y = 酪氨酸 V = 缬氨酸 D = 天门冬氨酸 I =异亮氨酸 核苷类似物 拉米夫定 ss （-） DNA 弱抑制 HBV 聚合酶（变异株） 亲和力下降 V D Y D 在细胞培养体系中YMDD变异株复制水平显著低于野生株 （Melegari et al， Hepatology 1998; Allen et al, Hepatology 1998） YMDD 变异株 （YVDD and YIDD）与核苷类似物的结合能力显著下降 (Chayama et al，Hepatology1998; Back et al，EMBO J，1996) 第第 五五 正确认识将来的乙肝疫苗的免正确认识将来的乙肝疫苗的免 疫预防效果。疫预防效果。 应该及早设计新型疫苗！应该及早设计新型疫苗！ 第第 六六 正确认识目前的诊断试剂的漏正确认识目前的诊断试剂的漏 检率会不会逐渐提？检率会不会逐渐提？ 应该及早试验新型诊断试剂！应该及早试验新型诊断试剂！ 第第 七七 献血员的筛选方法是否继续有献血员的筛选方法是否继续有 效，输血是否安全？效，输血是否安全？ 应该及早重视新的献血员筛选办法！应该及早重视新的献血员筛选办法！ 第第 八八 多少药物，什么样的药物才能多少药物，什么样的药物才能 完全解决抗乙型肝炎病毒的治疗问完全解决抗乙型肝炎病毒的治疗问 题？题？ 越来越多的抗生素也不能完全解决细菌感越来越多的抗生素也不能完全解决细菌感 染问题？染问题？ 第第 九九 如何选择抗病毒药物？不同的如何选择抗病毒药物？不同的 乙肝病毒准种群对不同的抗病毒药乙肝病毒准种群对不同的抗病毒药 物敏感性存在差别，为什么没有把物敏感性存在差别，为什么没有把 乙肝病毒的准种特点这一因素，作乙肝病毒的准种特点这一因素，作 为选择抗病毒药物选择的条件之一为选择抗病毒药物选择的条件之一 ？ 细菌体外药敏试验有什么提示？细菌体外药敏试验有什么提示？ 第第 十十 我们不能全部消灭细菌，我们我们不能全部消灭细菌，我们 最终能全部消灭病毒吗？最终能全部消灭病毒吗？ 人与细菌的长期共存有什么提示？人与细菌的长期共存有什么提示？ 结结 论论 准种是乙型肝炎病毒存在的基本方式。准种是乙型肝炎病毒存在的基本方式。 如果不充分重视乙型肝炎病毒准种的研究，如果