细胞与免疫学技术ppt课件

细胞与免疫学技术 考试要求 1.实验报告、平时表现等占30%； 2.操作考试：占20%。 3.理论考试：（闭卷）卷面100分，占50%。 实验课程的整体思路 v 实验前的准备工作 v 单克隆抗体的制备相关实验 v免疫学经典实验 消毒灭菌方法消毒灭菌方法 vv物理消毒灭菌法物理消毒灭菌法 vv紫外线：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进紫外线：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进 行消毒的培养器皿，行消毒的培养器皿，如塑料培养皿、培养板等如塑料培养皿、培养板等 30min30min vv湿热（高压蒸气灭菌法）：主要应用范围是布类、橡湿热（高压蒸气灭菌法）：主要应用范围是布类、橡 胶制品（如胶塞）、金属器械、玻璃器皿、某些塑料胶制品（如胶塞）、金属器械、玻璃器皿、某些塑料 制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液（如制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液（如HanksHanks液液 、PBSPBS等）。等）。 121121，20min20min vv干烤：干烤：主要用于玻璃器皿的灭菌，主要用于玻璃器皿的灭菌， 160, 2 160, 2 小时小时 vv过滤：过滤：0.220.22mm 实验前的准备工作实验前的准备工作无菌操作无菌操作 vv化学消毒灭菌法化学消毒灭菌法 vv75%75%酒精酒精 vv主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内 的壁面处理的壁面处理 vv11新洁尔灭新洁尔灭 vv主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试 消毒消毒 单克隆抗体的制备相关实验 1.细胞的原代与传代培养 2.细胞的冻存与复苏 3.ELISA的方法检测抗体 4.双向琼脂扩散实验 消化液消化液 vv分离组织和分散细胞分离组织和分散细胞 vv常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二 钠钠(EDTA)(EDTA)两种溶液两种溶液 vv单独或混合使用单独或混合使用 消化法培养？Or 组织块培养？ 培养细胞的结果观察 v2448小时后若培养液变成黄色且混浊 ，表示已被污染； v若培养液变成紫色，一般细胞生长不好 ，则培养液pH过高； v若培养液显为橙黄、橘红且清澈，一般 显示细胞生长良好。 细胞冻存与复苏细胞冻存与复苏 实验原理实验原理 细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻 存技术将细胞置于存技术将细胞置于-196-196度液氮中低温保存，可以使细度液氮中低温保存，可以使细 胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样 在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且起到了细胞在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且起到了细胞 保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式 来购买，寄赠，交换和运送某些细胞。来购买，寄赠，交换和运送某些细胞。 冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻 损伤的物质。在溶液中加入冷冻保护剂，则损伤的物质。在溶液中加入冷冻保护剂，则 可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。因为可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。因为 冷冻保护剂容易同溶液中的水分子结合，从冷冻保护剂容易同溶液中的水分子结合，从 而降低冰点，减少冰晶的形成，并且通过其而降低冰点，减少冰晶的形成，并且通过其 摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度，摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度， 使细胞免受溶质损伤，细胞得以在超低温条使细胞免受溶质损伤，细胞得以在超低温条 件下保存件下保存 。 冷冻保护剂的作用冷冻保护剂的作用 如何运用如何运用“ “缓慢冻存，快速缓慢冻存，快速 复苏复苏” ”的原理保存细胞？的原理保存细胞？( (细胞冻细胞冻 存的实验步骤存的实验步骤) ) 细胞计数板 v 查出四个大方格的总细胞数(X) v 算出每个大方格的细胞数：Y=X/4 v 每个大方格的体积为V=1mm1mm0.1mm=0.1mm3=10-4ml v 制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y 104稀释倍数 4 细胞计数的方法 ELISA实验原理 v酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA ）： 以待测抗原（或抗体）与酶标抗体（或 抗原）的特异结合反应为基础，通过酶 活力测定来确定抗原（或抗体）含量。 v因为结合了免疫反应和酶催化反应，所 以是一种特异而又敏感的技术。 此法是测定抗体最常用的方法。将已知抗原吸 附于固相载体，加入待检标本(含相应抗体)与 之结合。洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体(酶 标抗抗体)和底物进行测定。 间接ELISA 抗原抗原 第第1 1抗体抗体 酶酶 第第2 2抗体抗体 待检抗体待检抗体 底物底物 有色产物有色产物酶标仪检测酶标仪检测 技术原理：技术原理： v双抗体夹心法。此法常用于测定抗原, 将已知 抗体吸附于固相载体, 加入待检标本(含相应 抗原)与之结合。温育后洗涤，加入酶标抗体 和底物进行测定。 v 竞争法。此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可 用于测定抗体。以测定抗原为例, 将抗原吸附于固相 载体；加入待测抗原和一定量特异性抗体，使固相抗 原与待测抗原二者竞争与抗体结合；经过洗涤分离， 最后结合于固相的抗体与待测抗原含量呈负相关。 vELISA实验操 作过程（见实验 指导书或报告） 双向免疫扩散实验原理 双向免疫扩散实验是将抗原抗体分别加入琼脂 板相对应的小孔中，使二者相互扩散，在比例适 当处形成可见的沉淀线。我们通过观察沉淀线的 位置、数量、形状以及对比各沉淀线的关系可对 抗原或抗体进行定性分析，常用于抗原抗体纯度 的鉴定，也可以对抗体的效价进行初步估算。 加样、扩散及结果观察 注意：加样至孔满为止， 不可外溢。待孔内液体渗 入凝胶后即可放于温盒中 。湿盒于37中，一般保 温2448h，观察抗原抗 体产生的白色沉淀线。 每孔加入 抗原/抗体10l Ag 空白 1：4 Ab 1：8 Ab 1：16 Ab 1：32 Ab 1：64 Ab A B C D E F Ag Ab 以上六种情况中抗原和抗体的浓度差异（用 、表示） 免疫学经典实验免疫学经典实验 淋巴细胞转化实验 淋巴细胞转化试验原理淋巴细胞转化试验原理 该试验是检测机体细胞免疫功能的一种体外试验。T淋巴 细胞在体外培养时、当受到非特异性刺激物如植物血凝素 (PHA)、刀豆蛋白A(ConA)等有丝分裂原和特异性抗原刺激后 可转化为淋巴母细胞。通常