功能性低聚糖研究进展课件

功能性低聚糖研究进展 The Research Advances and Application on Functional Oligosaccharides n一、概述 n二、功能性低聚糖的生理功能 n三、功能性低聚糖的来源和制备方法 n四、制备方法举例-果寡糖的制备 n五、功能性低聚糖制品的市场发展 n安全性问题 一、概述 n人体正常菌群 n益生菌的定义及常用益生菌 n益生元的定义及常用益生元 人体的正常菌群 n人体内的微生物以细菌为主，大约有几 十万亿到百万亿，重量1.5-2.0kg。 n肠道：大于1kg n肺：20g n口腔：20g n鼻孔：10g n眼：1g n皮肤：200g 机会菌 益 生 菌 有害菌 nP28图2-12 有害菌 益 生 菌 机会菌 益生菌的定义及常用益生菌 n益生菌的定义:益生菌(probiotics)是指对人和动植 物机体有益的菌。 n常用益生菌: n双歧杆菌（Bifidobacterium） n乳杆菌（Lactobacillus） n嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus ) n鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG, 简称LGG) n植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) n干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) n芽孢杆菌（Bacillus） 双歧杆菌 Bifidobacterium 60年代末 70年代初 ，肠道中 的优势菌 群双歧杆 菌 干酪乳杆菌 Lactobacillus casei 上述乳酸菌均为嗜热菌。最近：适温 益生菌干酪乳杆菌及植物乳杆菌 常用益生菌产品形式 n由益生菌生产的产品叫益生菌制品 n包括活菌体、死菌体、菌体成分及代谢产物。 n主要形式 n酸奶（最有名）（牛奶为培养介质） n各种酸奶、养乐乐多、优优酪乳 n泡菜（蔬菜为培养介质） n那豆、酸豆浆（大豆为培养介质） n其他形式 n胶囊剂 n益生菌片剂 n益生菌冲剂 n益生菌口服液类产品 n益生菌发酵果蔬汁 n益生菌微胶囊制剂 常用活菌体益生菌产品的缺陷 n稳定性较差。 n须低温保藏（-4） n保质期短 益生元的定义及常用益生元 n益生元定义（1995年Gibson和 Roberfroid首次提出） n不被宿主胃肠道消化或吸收，能够完整达到 大肠； n能够选择性地刺激一种或几种有益细菌在宿 主肠道内的生长； n不能促进肠道中有害菌的代谢和增殖； n进而促进宿主的健康。 n结肠食品定义 n不被宿主胃肠道消化或吸收，能够完整达到 大肠； n能够肠道内微生物（有益及有害微生物）的 生长。 n益生元是一种结肠食品 常见的益生元 n纯寡糖类物质 n由2-10个单糖通过糖苷键聚合在一起而形成，如果 糖、木聚糖、半乳寡糖等。也称功能性寡糖或功能 性低聚糖。 n蛋白质水解产物及一些蛋白质物质 n胃黏膜蛋白水解产物（其生物活性物质部分为糖蛋 白中的寡糖）、酪蛋白水解物、牛奶中的-乳清蛋 白和乳铁蛋白等。 n多糖类物质 n灵芝多糖的水解物、胡萝卜中的含氮多糖 n天然植物及中草药的提取物 n茶叶中的茶多酚、人参中的人参皂甙及五加科植物 的水提物 n一些多元醇（polyols） n木糖醇(xylitol)、甘露醇（mannitol）、山梨醇 （sorbitol） n培养乏液（spent culture） n双歧杆菌与乳杆菌培养后的液体培养基上清液。 n上述几类双歧因子中，寡糖及糖基化类 物质占主要部分，也是目前益生元的主 要来源。 n非消化性寡糖。 益生元的功能检测 n体外、体内检测方法验证益生元的功能 。 n首先要确定其不被消化道消化而能够完整达 到大肠，并且能够在大肠内选择性发酵。这 可以在体外模拟肠道内环境实现。 n其次是检测双歧杆菌等益生菌的增殖和活性 。 n最后通过体外发酵、动物实验或人体实验检 测其对免疫功能、脂质和致病菌的影响。 非消化性寡糖 n国际纯粹和应用化学联合会（IUPAC- IUB）定义寡糖为2-10个单糖通过糖苷 键构成的化合物。 n通常至少有90%不能被利用而到达大肠 的糖类才能被认为是非消化性寡糖。 非消化性寡糖的生理功能研究 n非消化性寡糖生理功能的研究结果主要 来自于欧盟资助了一个为期超过3年的非 消化性寡糖项目（ENDO Project， DGXII AIRII-CT94-1095）（Van Loo 1999）， n该研究结果将非消化性寡糖的生理功能 性质划分为三个层次： n充分实证的（strong），即得到人体实 验确证的； n有希望的（promising），即对人体功 能效果需进行进一步确证的； n初步的（preliminary），即只进行了实 验动物研究的。 n主要生理功能 n改善肠道微生态 n提高肠道对钙等矿物质的吸收 n改善脂质代谢 n预防肠道癌变、增强机体免疫力 改善肠道微生态-体外发酵 改善肠道微生态-人体实验 n进行人体益生元功能试验是极其耗时和 繁重的工作。经典的平板记数技术是该 研究的瓶颈。目前，基于16S rRNA探 针和细菌脂肪酸分子标记的先进微生态 生物研究技术的使用，为大规模、长时 期的人体试验研究提供了有效途径。 n非消化性寡糖的肠内发酵能产生气体、短链脂 肪酸和乳酸，从而起到通便的效果。 n能产生理论上至少300g/kg（干重）的菌体量 ，这将能增加排粪量和干物质含量。 n每摄入1g非消化性寡糖，就能够导致1.5-2g 的排粪量，同时使排便频率趋于正常，这对于 改善小儿和老人的便秘是有益的。 提高肠道对钙等矿物质的吸收 n动物实验 n菊糖和转半乳糖基寡糖对矿物质如钙、镁、 铁的吸收促进作用已在鼠中得到证实。 人体实验 n使用不同模型的研究结果表明对矿物质 吸收的增加主要发生在大肠。 n对矿物质的吸收能够增加骨密度，从而 为食用菊糖防治骨质疏松提供了依据。 改善脂质代谢 n非消化性寡糖对脂质代谢影响的研究仅局限于 菊糖和果寡糖。 n小鼠实验 n以含10%菊糖的剂量饲喂小鼠，其血清甘油酸三 酯水平下降。超过12周的饲喂后，能够观察到胆固 醇的下降。 n人体实验 n初步结果说明摄入适量的菊糖或果寡糖对脂质代谢 有一定效果。 预防肠道癌变、增强机体免疫力 n动物实验 n研究了菊糖和果寡糖或与双歧杆菌结合使用 ，对实验鼠的防癌效果。 n实验鼠因实验诱导了肠道癌。 隐窝异常病灶(ACF)，上皮细胞的上皮-间质转 化（ EMT）。 继续开展非消化性寡糖对人体 健康的生理功效的研究 益生元的作用机制 n促进双歧杆菌增殖，调整肠道菌群及代谢 n双歧杆菌、乳杆菌等有益菌一般是通过分泌到胞 外的糖苷酶将寡糖降解后再吸收利用的。 n双歧杆菌所产生糖苷酶的种类 n-呋喃果糖糖苷酶、-葡萄糖苷酶、 -半乳糖苷酶等 6种酶。肠道中的致病菌不产生这些糖苷酶。 n乳酸菌产生的短链脂肪酸使肠道pH降低，从而 使钙、镁、铁盐的溶解度升高并促使钙等离子的 吸收。 n抑制病原菌定植，促进其随粪便的排泄 n肠道病原菌必须首先与肠黏膜粘接才能在胃 肠道定植和繁殖而致病。现已证实，大多数 肠道病原菌具有对甘露糖特异结合的外源凝 集素。 n实验证明，粘连在上皮细胞的大肠杆菌碰到 甘露糖后可在30min内脱落下来，但葡萄糖 和半乳糖则对附着的细菌无作用。 n阻止细菌与肠黏膜结合的方法（化学益生 ） n用特定的糖（如甘露糖）结合细菌的外源凝集 素 n或用特定的外源凝集素结合肠黏膜上皮细胞表 面的糖脂或糖蛋白的糖残基。 n刺激免疫应答，提高机体免疫力 n寡糖能与一定毒素、病毒、真核细胞的表面 结合而作为这些外源抗原的佐剂，能够减缓 抗原的吸收。 n寡糖也具有抗原特性，能够产生特异性的免 疫应答。 n另外，含甘露糖的寡糖也可以通过刺激肝脏 分泌与甘露糖结合的蛋白而影响免疫系统。 益生元的安全性 n有效摄入量和摄取限额 n只对部分非消化性寡糖做了动物和人食用初 步研究。 n有效摄入量 n果寡糖3.0g/d n半乳寡糖2.0-2.5g/d n大豆寡糖2.0g/d n木寡糖0.7g/d n摄取限额 n大豆寡糖引起腹泻的最小剂量：男性44g/d n急性毒理实验 n半乳寡糖LD5015kg体重/g n大豆寡糖LD5010kg体重/g n亚急性和慢性毒理实验 n每天每千克体重摄入寡糖4.0g持续35- 180d是安全的。 n小鼠亚慢、慢性毒理实验和致突变实验 n每天每千克体重摄入果寡糖2.17g也无明显 不良反应。 n因此，寡糖毒性极小。 n每天饮用含3.0g大豆寡糖的碳酸饮料 100ml持续2周，不会引起肠胃胀气，也不 会出现腹泻。 益生元的来源和制备方法 n从天然原料如动、植物组织及益生菌菌 体中提取 n化学合成法制备（产量低，费用高，难 以实现商业化生产） n天然多糖的酸法水解（反应不易控制） n酶法合成（微生物） n天然多糖的酶法水解（微生物） 从天然原料如动、植物组织及 益生菌菌体中提取 n从大豆中提取 大豆低聚糖 n猪胃黏膜提取 结晶二糖 n胡萝卜中提取 含氮多糖及寡糖 n壳多糖中提取 壳聚糖 n动物肝脏、胰脏中提取 n牛奶中提取 n双歧杆菌菌体中提取 酶法合成（微生物） n淀粉、蔗糖、乳糖为原料合成寡糖 n常用的微生物酶 n糖基转移酶 n糖苷水解酶 n磷酸化酶 天然多糖的酶法水解（微生物 ） n多糖原料 n纤维素、半纤维素、甲壳素、藻类 n多糖的降解涉及的酶 n纤维素酶、淀粉酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶 等水解酶类 n海藻多糖裂解酶等裂解酶类 n已大规模生产的甘露寡糖、木寡糖、果 寡糖类都采用了来源于微生物的水解酶 。 重要的非消化性寡糖及其应用 n果寡糖（fructo-oligosaccharides ） n木寡糖（xylo-oligosaccharides ） n半乳寡糖（galacto-oligosaccharides ） n甘露寡糖（manno-oligosaccharides ） n低聚乳果糖（lactosucrose） 果寡糖 G指葡萄糖，F指果糖。Fm代表均果寡糖，GFn代表杂果寡糖 。 连接的糖苷键是（12） n果寡糖在果蔬、谷物中天然存在。 n耶路撒冷菊芋：16-20% n菊苣：5-10% n芦笋：1-20 n韭菜：2-5% n大蒜：3-6% n洋葱：2-6% n葡罗门参：4-11% n牛蒡：3.6% n小麦：1-4% n日本 n果寡糖最早由日本的明治制果公司研究开发 ，于1984年进入市场。 n日本厚生省于1992年批准果寡糖为特定保 健食品。 n20年代80年代末，其产量已达到4000吨以 上，1998年含果寡糖的各种产品在日本的 销售额达50亿美元。 n日本的明治制果公司在韩国有协作生产厂。 n韩国 n三星集团的长一制糖厂。 n欧洲 n荷兰、比利时、瑞典和英国等国家的许多大学和科 研机构都竞相开展有关裹寡糖的研究，并已经将其 作为控制胆固醇水平的功能性甜味剂广泛应用在许 多食品中。 n美国 n膳食补充剂、药品和功能食品中的一种成分，以片 剂、胶囊、粉剂、口服液等形式在全美市场上销售 。 n商品果寡糖 n均果寡糖 n比利时Rafinerie Tirlemontoise S. A. 公司和Consucra 公司以菊粉多糖为原料生产的Raftilose和Fibruline。 n杂果寡糖 n日本的明治寡糖（Meioligo） n欧美商品Neosugar、Nutra Flora的果寡糖 n中国的天元B型 n台湾富力得 n生产方法： n以菊苣的块根为原料水解生产 n均果寡糖 n以微生物酶法转化生产（主要方法） n杂果寡糖：在蔗糖分子的果糖残基上以（12 ）糖苷键结合1-3个果糖而形成蔗果三糖、蔗果 四糖、蔗果五糖 n以微生物酶法转化生产杂果寡糖 n原料 n蔗糖 n酶 n-果糖转移酶（ fructosyltransferase， EC 2.4.1.9） n-呋喃果糖苷酶（ fructofuranosidase， EC 3.2.1.26） n酶的来源 n高等植物（产量低、且受季节的限制） n洋葱、甜菜、芦笋、菊苣、龙舌兰等 n微生物 n酵母 n产生的酶可以产生以蔗果三糖为主的数种果糖，但最 终将寡糖水解成葡萄糖和果糖。 n霉菌 n高产黑曲霉（Aspergillus niger）（日本） n成功地应用于果寡糖的生产 n米曲霉（Aspergillus oryae） n出芽短梗霉（Aureobasidum pullulans） （韩国） n海枣曲霉（Aspergillus phoenicis） n短梗帚霉（Scopulariopsis brevicaulis） 等 n微生物来源酶的特性 n大多数为胞内酶 n最适pH为5-6.5 n最适反应温度为50-60 n底物蔗糖浓度可高达700-800g/l n反应过程受杂菌污染的可能性较小 n有利于工业化生产 n生产工艺 n利用固定化增殖细胞连续化生产果寡糖。 n黑曲霉种子培养基及培养条件 n5-10%蔗糖液，可适当添加氮源物质（如蛋白胨 和NH4NO30.5-0.75%）和无机盐（如MgSO4和 KH2PO40.1-0.15%） n在30下振摇培养2-4d，获得具有较高的果糖转 移酶活性的黑曲霉菌体。 n过滤或离心收集菌体。 n发酵方法 n液体深层发酵法（中国） n固定化细胞法（日本、韩国） n液体深层发酵法 n将菌丝体连同培养基一起转入浓度为60% 的蔗糖溶液中，在搅拌的条件下通入无菌空 气，发酵，待果寡糖含量达到50-55%时停 止反应。 n糖浆经过除杂、脱色、过滤等工序后得到成 品。 n缺点在于后处理除杂的难度大，工艺复杂。 n固定化细胞法 n海藻酸钙包埋黑曲霉来固定细胞 n发酵培养基及发酵条件 n50-60%，或60-85%蔗糖溶液；增加Mg2+离子浓度可 提高酶活； npH维持在5.5以上很重要； n转化温度50-55； n以一定速率流过固定化酶或固定化床（柱状恒温反应器） ，使酶作用于蔗糖发生反应。 n可连续生产3个月。 n脱色 n活性碳 n脱果糖、葡萄糖？ n膜分离技术 n脱盐 n离子交换法 n浓缩 n果寡糖含量为55-60%的液体糖浆制品 n精制 n果寡糖含量为95%的高纯度果寡糖产品。 n有关技术问题 n保持固定化细胞反应器无菌 n增加糖液流速 n改进除杂和脱盐技术 n果寡糖的用途 n作为食品、药品的重要功能配料 n奶粉 n日本明治乳业公司出品的含果寡糖森永牌奶粉 n碳酸饮料 n台湾的“奥利多”和“奥雷特”饮料 n发酵奶制品 n作为钙、铁、锌等人体微量元素补充剂的活化因子 n用于各种酒类 n用于各种果味纯水和茶饮料中 n作为甜味剂 n奶制品、饮料、糖果、冷冻甜品、面包、果冻布丁、保健酒 益生元的市场发展 n益生元与益生菌、膳食纤维相比，在加工、保 藏、运输以及功效等方面具有明显的优越性。 n与膳食纤维相比，非消化性寡糖益生元的日需求量 较少，一般不易引起腹泻，组织特性和口感更好， 易溶于水，理化性质稳定，易于添加到食品与饮料 中。 n在日本保健品市场，最初为益生菌制品占优势，近 年来，益生元制品的市场份额已经超过益生菌制剂 。 n在日本和欧洲，以功能性寡糖开发 的食品多达400-500种。 n日本 n日本在益生元，尤其是在非消化性寡糖的 研究、开发和市场发展方面均走在世界前 列。 n一方面，是由于该类寡糖良好的生理性状和 独特的生理功能，有助于防治龋齿、肠胃病 、便秘、胆固醇等脂质代谢不良、大肠爱等 ，加之日本人对肠道内双歧杆菌与人体健康 的关系有较全面和深刻的认识。肠内双歧杆 菌比率的多少已成为日本人衡量人体健康水 平的一个标志。 n另一方面，是由于日本工业化制造 新型寡糖的技术水平较高，生产出 来的产品在法制、政府支持、社会 接受度等方面具有有利条件。目前 ，日本是世界平均寿命最高的国家 ，这与他们注重食品