分析方法在中药药代动力学研究中的应用课件

LOGO 分析方法在中药药代动力学 研究中的应用 药物分析 任恒鑫 中医中药历史悠久 现代医学如何解开中药体内过程的奥秘？ 中药药代动力学 中药药代动力学研究 血药浓度法 中药药代动力学 生物效应法 药理效应法药物累积法 微生物指标法 血药浓度法： 该研究方法与化学药物的药代动力学研究原 理、方法相似。是以一种或几种药理作用明 确，结构已知的有效成分为指标，测定该成 分在血液或其他生物组织中的浓度随时间变 化过程，求出药代动力学参数，拟合药一时 曲线，确定药代动力学模型，以此来反映中 药及复方的药代动力学特征。 血药浓度与中药药代动力学参数 测定中的应用示例 离子对反相高效液相色谱法测定兔血 浆中氧化苦参碱含量 氧化苦参碱(oxymatrine)是从豆科植 物苦参(Sophora. flavescens Ait)、 苦豆子(S.alopecuroideL.）及广豆根 (S.subprostrata Chunet TChen)中提 取分离而得到的一种生物碱，是这几 种常用中草药的主要有效成分。 作者首次采用离子对反相高效液相 色谱法，以非那西丁为内标物测定 了血浆中氧化苦参碱的浓度，并对 氧化苦参碱在家兔体内的药代动力 学进行了研究。 1方法与结果 (1)色谱条件： 色谱柱:DiamonsilTMC18柱(200mmX4.6mmI.D.，5m) 流动相：乙腈-水(20:80，V/V，含庚烷磺酸钠5mmolL ，磷酸调Ph3.2)。 柱温：40。 流速：1.0mlmin。 检测：紫外检测器，220nm波长处。 灵敏度：0.01AUFS。 进样量：1l。 (2)血浆样品处理： 精密吸取血浆0.4ml，置于5ml具塞离心管中 ，依次加入重蒸馏水0.2ml，内标溶液100 l ，6HClO40.4ml，旋涡混合30s，离心 (10000r/min)5min，上清液转移至10ml离心管 中，加5mol/LNaOH溶液0.4ml，氯仿-正丁醇 (98:2，v/v)提取溶液4ml，旋涡混合lmin，离 心(4000r/min)10min。吸取下层有机相，40 水浴氮气吹干，残渣用200l流动相溶解，旋 涡混合30s，离心(15000r / min) 5min。取上清 液1l进样，记录色谱图。 (3)专属性： 在实验条件下，血浆中杂质不干扰样品及内标物的测定，氧化苦参碱及内标 物的保留时间分别为6.5min和20.2min，二者能够完全分离. (4)标准曲线与线性范围： 以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的 峰面积比值为纵坐标，用加权最小二乘法 进行回归运算， 求得直线回归方程为: y=0.01358+0.18728X，r=0.9965。 线性范围为: 0.5100mgL。 (5)准确度与精密度： 准确度与精密度数据如下:RE为-4.14.0； 日内RSD3计。 (5)回收率： 芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚相对回收率 为94.6102.4，RSD为1.85.5，n=5；萃 取回收率为69.6576.69(芦荟大黄素74.91， 75.70，75.08；大黄酸75.58，76.50，76.69 ；大黄素73.22，75.76，76.43；大黄酚 70.05，69.65，72.45；内标69.78，70.56 ，70.85)。 (6)精密度： 芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚日内RSD均 为0.574.7(n=5)；日间RSD均为0.558.2 (n=5)。 (7)大黄药材提取液与复方WPY颗粒在大鼠体 内组织分布研究：6只大鼠分别于灌胃后1，2 ，4，6，12h自股动脉取血，分取出心、肝 及肾组织，用枸橼酸盐缓冲液(pH6.2)冲洗干 净，滤纸吸干水分，称定重量。分别加枸橼 酸缓冲液2.0ml磨成匀浆，按照确定的方法进 行处理和测定，测定结果表明含大黄的单、 复方制剂中蒽醌类衍生物在大鼠体内的分布 以肾脏半分布最高，血浆、心脏、肝脏中的 分布依次降低。 2.讨论 (1)大黄蒽醌类衍生物与葡萄糖醛酸结合成苷时为水溶 性物质，而其蒽醌母核结构为脂溶性化合物，我们在建 立HPLC法进行测定时，主要是对蒽醌苷元进行测定， 因而应将水，溶性的苷水解成脂溶性的蒽醌衍生物。将 苷水解为苷元的方法有酸水解、碱水解和酶水解等多种 方法，从易操作性和实验费用角度综合考虑，我们决定 从酸水解的角度来进行生物样品的预处理方法的考察， 在综合考察水解方法、萃取溶剂种类、水解的温度、水 解用酸的种类、酸的浓度的基础上，决定选用15的硫 酸水浴(702)30min水解待处理的生物样品，使其 中的苷水解为苷元便于测定。 (2)由大黄蒽醌衍生物结构可知，为具强紫 外吸收的脂溶性、弱酸性物质，在进行色 谱条件筛选时，选用可限制各组分离解的 离子抑制色谱法使各个组分均处于分子状 态，从而使各个色谱峰之间达到基线分离 且峰形对称。各成分的保留时间分别为： 芦荟大黄素：7.11min；大黄酸：8.06min； 大黄素：14.46mira内标：15.97min；大黄 酚：20.16min。 (3)由于组织匀浆中含有大量的内源性物质， 不能采用与血浆样品相同的预处理方法对组 织样品进行处理。鉴于内源性物质大多具水 溶性，我们在综合考察固相萃取及液一液萃 取方法的基础上，选用乙醚萃取出待测物质 ，再用水洗涤萃取物中的大量内源性物质， 从而消除内源性物质对蒽醌类衍生物测定的 干扰 中药代谢物研究中的应用示例 液相色谱-质谱联用法(LCMS)示例液相色 谱-串联质谱法鉴定大鼠血浆中的东莨菪 碱及其代谢物 v 东莨菪碱(scopolamine)是从茄科 植物颠茄(Atropa belladonna L.)、 曼陀罗(Datura Stramonium L.)及 莨菪(Hyosyamus nigerL.)等分离 提取的一种托品烷类生物碱。 v 为全面阐明该药在大鼠体内的代 谢过程，本实验利用LC-MSn技 术，对服药后的大鼠血样进行了 定性分析，鉴定出了原药及其7 种代谢物。 1实验部分 (1)色谱条件： Zorbax ExtendC18不锈钢色谱柱(3.0mm100mm， 3.5m) 同种填料的色谱保护柱(2.1mm12.5mm，5m)。 流动相：甲醇-2mmolL醋酸铵水溶液(以甲酸调节 pH3.5) (70:30，VV)。 流速：0.2mlmin。 柱温：40。 进样量：20l。 (2)生物样品的制备： 6只健康Wister大鼠250g10g。大鼠禁食12h，按 50mgkg灌胃给药东莨菪碱后，分别于15min、 45min、2h、18h和24h眼眶取血，肝素抗凝，以 5000rmin离心10min，上清液置于-70冰箱中 保存备用。取各时间点的血浆，加3倍量甲醇沉淀 蛋白，离心，上清液过0.45m微孔滤膜，滤液用 于LC-MSn分析。 (3)质谱条件： ESI离子源，扫描范围：1001000mz。离 子源喷射电压：4.5kV。毛细管电压：21V。 毛细管温度：175。鞘气(N2)流速：40个单 位。自动进样器直接进样，正、负离子方式 检测。采用全扫描一级质谱(Fullscan)及其源 内碰撞诱导解离(S-CID)、全扫描二级质谱 (Full scanMS2)及三级质谱(Full scanMS3)等方 式进行测定。仪器自动优化的二级及三级相 对碰撞能量均为30。 v 2结果与讨论 (1)大鼠血浆中母体药物及其主 要代谢物的鉴定：在大鼠血浆 样品中发现了东莨菪碱及其代 谢物，其LC-MS色谱及其对应 的二级质谱分别见图9-12和图 9-13 v 分子离子mz304(M0)的 保留时间(2.91min)及其二 级质谱(图9-13-F)和东莨 菪碱相同，所以，M0即为 未被代谢的原药； 分子离子m/z156(M1的二级质谱和原药的三级质谱 m/z304-156相同，且出现原药的碎片m/z138、110和 98，所以，M1应该是东莨菪碱大鼠体内的水解产物， 即莨菪品。 分子离子m/z142(M2)及其二级碎片m/z124、114、96、84、 70/分别比m/z156(M1)及其二级碎片m/z138、128、110、98 、84少14Da，可以鉴定M2为M1的N-去甲基产物。 m/z286(M4)的分子量比原药少18Da，而特征碎片m/z110和 138均出现在其二级质谱中，M4应该是东莨菪碱大鼠体内脱水 产物。 m/z272(M3)及其二级碎片离子m/z254、124、96分别比m/z286 (M4)及其二级碎片离子m/z268、138、110少14Da，M3可被鉴 定为M4的N-去甲基产物。 m/z290(M5)丢失148、166Da分别产生碎片m/z142和124， m/z290及其二级碎片离子m/z272、260、142、124、96分别比 m/z304(M0)及其二级碎片离子m/z286、274、156、138、110少 14Da，M5可以鉴定为东莨菪碱的N-去甲基代谢物。 m/z320(M6)比m/z304多16Da，说明：M6是东莨菪 碱的氧化产物，而碎片离子m/z156和138的出现反 映出该氧化位置在托品酸部分，失水碎片离子 m/z302的出现说明苄基氢的存在，即M6为东莨菪 碱在苯环上的氧化产物。 在大鼠血浆的负离子一级质谱中出现了mz165(M7)，其二级质 谱碎片mz147(M-H-H20-)和mz121(M-H-CO2-)的出现显 示，M7应为东莨菪碱水解产物的另一部分，即托品酸。 结论：在服药后的大鼠血样中发现7种代谢物： M1：莨菪品 M2：N-去甲基莨菪品 M3：N-去甲基脱水东莨菪碱 M4：脱水东莨菪碱 M5：N-去甲基东莨菪碱 M6：氧化东莨菪碱 M7：托品酸 在各时间点血样的测定中，15rain至18h 的血样中均鉴定出了东莨菪碱及其代谢物 MIM7，而在24h血样中只有M0、M1、 M2、M6和M7，说明M3、M4和M5含量 较少，排泄较快。各时间点的血样中均未 发现二相代谢物。 (2)本法的灵敏度与专属性： 东莨菪碱溶液用流动相稀释至不同的浓度，经LC- MS2检。测，检出限LOD为5gL。10gL东莨 菪碱在血样中的平均回收率为73.5(n=5)。本实验 以原药的特征碎片及特征中性丢失为依据，通过 LC-MS数据鉴别代谢物，原药及空白血样中没有发 现这些代谢物，完全可以排除内源性物质的干扰。 因此，本方法灵敏度高，专属性好。 中药生物利用度和生物等效性 测定的应用示例 蛇床子素包和物的制备及其兔体 内生物利用度测定 v 蛇床子为伞形科植物蛇床(Cnidiummonnieri L.Cuss.)的干燥成熟果实。始载于神农本 草经，列为上品。蛇床子主要有效成分为 数种香豆素类化合物，其中蛇床子素(甲氧基 欧芹酚，osthol)含量最高，约占0.8左右， 约占总香豆素的60，可以作为实验室研究 及生产性工艺提取效率的指标成分。 v 蛇床子素及其他香豆素均为脂溶性化合物，几乎不 溶于水，口感麻辣，口服后对胃有烧灼感，化学性 质不稳定，见光易分解。临床上所用制剂大多为外 用剂型如洗剂、栓剂等，本实验将蛇床子素制成蛇 床子素包合物(inclusion complex of osthol)，使其包 藏于p环糊精(-CD)分子内，提高蛇床子素分子的 稳定性，增加其水溶性，掩盖其麻辣味，并加快药 物的溶出速率，提高生物利用度等。 1方法与结果 (1)蛇床子素环糊精包合物的制备：以逆向混合 搅拌法，主客分子比为1:1制备。即称取蛇床子 素244mg溶于20ml无水乙醇中，于恒温磁力加 热搅拌器上50搅拌至全溶，转速800r /min， 将1135.0mg-CD溶于30ml纯化水中，同温搅拌 溶解后，缓缓滴人蛇床子素醇溶液中，持续约 1h，搅拌5h，挥散乙醇，使溶液浓缩至约30ml ，置冰箱中冷藏24h，抽滤。沉淀物依次用少量 纯化水和醋酸乙酯快速洗去未包合的蛇床子素 和-CD后，低温(约40)避光干燥，即得。整 个试验过程保持避光。 (2)色谱条件： 色谱柱：YMG-C18(4.6mm250mm，10m)。 流动相：甲醇-水(80-20，v/v)。 流速：lml/min。 检测：紫外检测器，322nm波长处。 柱温：25。 (3)标准曲线和灵敏度： 于7支干燥离心管中，各加入0.5ml空白血浆，依次加入 蛇床子素系列标准乙醇溶液51，配制相当浓度分别为0 ，0.2，0.6，1.0，2.0，6.0，12.0mg/L的血浆样品，振 荡数秒，无水乙醚提取3次，每次用2ml，涡旋30s，离 心，合并乙醚提取液于45水浴中挥干，残渣加101无 水乙醇溶解，过滤(0.45m)，进样21，以标准液的峰 面积对浓度进行回归得到标准曲线回归方程： A=11.607C1.0918 (r=0.9964)。 检测范围为0.212mg/L，最低检测限为0.2mg/L。 4)方法的回收率与精密度： 取空白血浆分别加入蛇床子素使成1.0，6.0， 12.0mg/L3个浓度，3种浓度的 平均回收率分别为: 96.0，98.1，95.1。 连续测定2d，日内、日间RSD均小于6。 (5)血浆样品处理与测定： 取健康家兔10只，(体重约1.82.5kg)，随机分成2组