基因工程干扰素

单击此处编辑母版标题样式 单击添加署名或公司信息 n 基因工程操作流程 Page 2 n 利用ncbi查找目的基因序列 n 利用oligo设计引物 n 利用PCR技术扩增目的基因 n 选择载体，抽提质粒 n 制备感受态细胞 n 目的基因与载体重组 n 外源基因导入受体细胞 n 重组子筛选 n 外源基因的表达 Page 3 利用NCBI查找目的基因 n 打开NCBI网站，我们查找了人类-干扰素的基因。 Page 4 Page 5 n 查找之后利用oligo软件设计引物 Page 6 Page 7 Page 8 查找酶切位点，点击search Page 9 Page 10 编辑上下游引物 Page 11 Page 12 n 得到上游引物为： n 5- GTCGGTACCGACGACGACAAGTGCGATCTGCCGCAG ACCCATA-3 n 下游引物为：5- TAAGAATTCTTATTATTCTTTGCTTTTCAGGCGT-3 Page 13 n 上游引物的酶切位点是Kpn1(GGATCC) n 下游引物的酶切位点是EcoR1(GGTACC) Page 14 利用PCR技术体外扩增目的基因 n 以上两条引物与表达载体的部分序列重叠，并覆盖Kpn1 和EcoR I两个酶切位点用以上经纯化的连接产物作为模 板，用上下游引物进行PCR扩增，PCR反应体系如下： n 模板 2ul n 上游引物V-100uM) 1ul n 下游引物F-200uM 1ul n 10XTaq DNA聚合酶缓冲液 5ul n dNTP混合物f各25mM) 4ul n MgCl2(25mlV0 3ul n Taq酶 1ul n dH20 33ul n 总量 50ul Page 15 n PCR反应条件如下： n 94 3min n 94 20s n 58 25s 20循环 n 72 25s n 72 5min Page 16 n 一般是94度变性5min，之后“94度变性、退火（不同引物 温度不同）、72度”延伸共30-35个循环，再72度延伸 10min，最后hold16度即可。反应体系一般有20微升或50微 升，由上下游引物、buffer、dNTP、模板、Taq酶和水等 组成，配好后放入PCR仪中按设定程序进行即可。 Page 17 Page 18 选择载体和抽提质粒 1、质粒DNA 的分离纯化 一般含有单个目的基因的DNA 片段，即使进入了宿主细胞 也不能进行增殖。通常它需要同适当的能自我复制的 DNA 分子（例如质粒、噬菌体DNA 等）结合后，才能在 通过转化或其他途径导入宿主细胞，像正常质粒或病毒一 样增殖和易于检测。 Page 19 n 分离质粒载体DNA 有许多方法，但其共同步骤是先用溶菌酶处理含 有质粒载体的宿主菌培养物，以除去其细胞壁，然后加入去污剂（例 如SDS），使其发生温和的溶菌作用。这样质粒DNA 、多聚核糖体、 可溶性蛋白质、tRNA 等细胞内的大分子物质便逐步地释放出来，而 核染色体的DNA 则仍然附着在细胞的残渣碎片上，经过离心处理， 可使其同质粒分开。将离心所得的含有质粒DNA 的上清液，加酚处 理除去蛋白。剩下的DNA 混合物中，质粒DNA （cccDNA ）呈超螺 旋状态。为进一步纯化出cccDNA 分子，可在含有溴化乙锭（EB）染 料和氯化铯溶液中进行密度梯度离心。EB是一种扁平分子，它能插 入双链DNA 分子的两个相邻碱基对之间，从而降低了DNA 分子在氯 化铯中的密度。又由于cccDNA 同EB的结合能力比开环DNA 和线性 DNA 低得多，这样在氯化绝密度梯度中便可容易地将cccDNA 同其他 两种类型的DNA 分离开来其他载体DNA 分高纯化的原理与上述类似 。 Page 20 2、目的基因与载体的连接。 外源DNA 片段与载体DNA 分子的连接，即DNA 分子的 体外重组，主要依赖于限制性内切核酸酶及DNA 连接酶 的作用。在进行连接时，一般需要注意以下几点： 实 验步骤尽可能简单容易； 在连接后，接点序列能被一 定的限制酶重新酶切，以便回收插入片段； 对转录和 转译过程中密码结构的阅读不发生干扰。 我们选择载体pET32a(+）Map Page 21 感受态细胞的制备 n 首先配制以下试剂： n 1)SOB培养基 n 配制500ml SOB培养基，在450ml水中加入以下试剂： n 胰蛋白胨(tryptone) 10g n 酵母提取物(yeast extract) 25g n NaCl 025g n 用电磁搅拌器搅拌使其完全溶解，然后加入250mmolL KCI溶液5ml，用NaOH调节溶液的pH值至70然后加 dH20定容至500ml，高压灭菌在使用前加入25ml经灭 菌的2mol/LMgCl2溶液。 Page 22 n 配置200 ml TB buffer，加入以下溶液： n KCl 40 ml n MnCl2 24ml n CaCl2 6ml n K-MES buffer 5ml n dH20 125ml n 总量 200ml Page 23 n 1)大肠杆菌(LB培养基含7DMSO保种)解冻，接种于LB平 n 皿上，37培养箱内培养过夜 n 2)挑取单克隆，转入500ml SOB培养基中，1813，摇床培养 1824h左右，直到OD600值达到06为止 n 3)从摇床上取出摇瓶，将菌体转到500mi离心管，冰浴 10min n 4)3500rpm，4，冷冻离心，10min，弃上清 n 5)用150ml冰浴过的TB buffer重悬菌体沉淀，再次冰浴 10min，按步骤4条件离心，弃上清 n 6)用40mlTBbuffer和28mlDMSO的混合液(DMS0的含量约 占7)再次重悬沉淀 n 7)冰浴10min，混匀，超净台内分装(每管0510m1)感 受态大肠杆菌，置液氮罐中冷冻保存用时从液氮罐中取 出放在冰上约20min，融化后即可用于转化 Page 24 n 按照酶切试剂盒的说明先用Kon 1分别对pET32a(+)载体和 目的基因进行酶切。37，酶切4h，用PCR纯化试剂盒纯 化，35.0uldH2O洗脱，然后再用EcoRI酶切.最后用15 的琼脂耱回收酶切后的pET32a(+)载体和目的基因质粒的 酶切片断，然后用T4 DNA连接酶，16连接回收片断， 转化至克隆菌。 Page 25 n 为了使连接反应物中尽可能多的外源DNA 片段插入载体 分子，以形成重组DNA ，必须阻止在限制酶切割后线性 载体分子的自身环化作用。具体可采用以下方法： n （1）用碱性磷酸酶处理限制酶酶解产生的线性载体分子. n （2）采用同聚物加尾连接技术，可自动防止线性载体 DNA 分子的自身环化作用，这是因为切割后形成的线性 DNA 分子的两个3-OH末端，此时都已被加上具有同样碱 基结构的同聚物尾巴。 n （3）应用柯斯质粒，也可防止质粒DNA 分子发生自身环 化作用。 Page 26 Page 27 目的基因导入受体细胞 n 目的基因的受体可以是植物、动物、微生物。 n 我们采用导入大肠杆菌细胞。 Page 28 转导方法 n 病毒颗粒转导法 n 磷酸钙转染法 其依据是哺乳动物细胞能捕获黏附在细胞表面的DNA-磷 酸钙沉淀物，使DNA转入细胞。 n 聚阳离子-DMSO转染法 采用聚阳离子poly-brene处理动物细胞，增加细胞表面对 DNA的吸附能力、然后再用25-30DMSO短暂处理细 胞，增加膜的通透性，提高对DNA的捕获量。 n DEAE-葡聚糖转染法 DEAE-葡聚糖能与外源DNA形成复合物，保护DNA免受 核酸酶的降解；其次是DEAE-葡聚糖可作用于受体细胞膜 ，增加其通透性，便于DNA进入。 Page 29 n 显微注射转基因技术 应用显微注射器可以把重组DNA直接注入动物细胞。 n 脂质体介导法 Page 30 重组子的筛选 n 将摄取外源DNA分子并能使该分子在其中稳定维持的受 体细胞统称为克隆子。 n 把采用各种转化方法或转导方法获得的克隆子叫做转化子 。 n 含有重组DNA分子的克隆子被称为重组子。 Page 31 n 根据载体选择标记初步筛选转化子在构建基因工程载体系 统时，通常在载体DNA分子中组装了一种或两种选择标记 基因，在受体细胞内进行表达，呈现出特殊的表型或遗传 学特性，作为筛选转化子的依据。 n 一般的做法是将转化处理后的受体细胞接种在合适量选择 药物的培养基上，在最适生长温度条件下培养一定时间， 根据菌落生长情况挑选出转化子。 n 常用的选择标记基因主要是抗性基因以及表达产物可以发 光或使反应底物显色的基因，相应的选择条件是可以被抗 性基因产物分解的抗生素和除草剂，可以使基因产物发光 的光线，或者是可以使基因产物显色的试剂。 n 选择培养基是根据宿主细胞类型配置的培养基，对于细菌 受体细胞而言，通常用LB培养基，在LB培养基中加入适 量的某种选择物即为选择培养基。选择物是由载体DNA 分子上携带的选择标记基因所决定。 Page 32 抗药性筛选 Page 33 n 我们选用的32号质粒中含有氨苄青霉素基因，所以可以通 过抗药性筛选出合适的重组子。 n 筛选方法：将重组细胞放入含有氨苄青霉素的培养基中培 养，能正常生长的是重组细胞。 Page 34 外源基因的表达 n通过表达载体产生目的蛋白的过程其实就 是基因表达的整个过程，所以表达载体需 要基因复制、转录、翻译所应具备的一系 列特征。 Page 35 n 外源蛋白，特别是相对分子质量较小的蛋白，在