厦门大学生命科学院生物化学课堂课件第六章培训讲解

单击此处编辑母版标 题样式 单击此处编辑母版副标题样式 *1 第六章 蛋白质的分离纯化 和表征 一、 蛋白质的性质 1. 蛋白质的酸碱性 蛋白质也是两性电解质，溶液的pH可以改变 蛋白质的带电情况。 蛋白质的等电点（等离子点）受组成蛋白质的 酸性氨基酸和碱性氨基酸数目的影响。 2. 蛋白质的大分子特性 a 渗透与渗透压 溶剂分子由稀溶液向浓溶液单方面的净移动称 为称为渗透。 渗透压是溶液分子在平衡浓度时的净水压，是 蛋白质的依数性之一。 b 蛋白质分子的扩散现象 由于浓度差导致的溶质分子的净迁移，称为扩散。 扩散系数的大小与蛋白质形状、大小及溶剂的粘度有 关。 c 蛋白质分子的沉降特性 蛋白质分子在溶液中受到强大的离心力作用时发生移 动的现象称为沉降。 沉降的速度与蛋白质分子的大小、形状、密度及溶剂 的密度和粘度、温度等有关。 沉降系数用S做单位。 d 蛋白质的胶体性质及沉淀 分散相质点的半径介于1- 100nm时形成的均匀分 散的溶液，称为胶体溶液。 蛋白质溶液作为胶体溶液，稳定的原因是蛋白质 分子表面的水化层和双电层。 沉淀蛋白质的方法： 大量的中性盐、 极性有机溶剂、 重金属盐、 生物碱试剂、 加热 二、 蛋白质的分离纯化方法 （一）根据分子大小不同的纯化方法 1. 透析和超滤 2. 密度梯度离心：蔗糖梯度、聚蔗糖梯度 3. 凝胶过滤层析( 分子排阻层析) 分离蛋白质常用的凝胶的商品名： Sephadex 某一蛋白质样品在凝胶柱上的分配系数 Kav = Ve: 该蛋白质的洗脱体积 Vo: 凝胶柱的空隙体积(外水体积) Vt : 凝胶柱的总体积 VeVo VtVo 凝 胶 过 滤 层 析 原 理 示 意 图 （三） 根据电荷不同纯化蛋白质 1. 电泳 纸电泳或薄膜电泳 粉末电泳 细丝电泳 凝胶电泳 平板电泳 柱状电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 （1 1） 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(PAGE) 浓缩胶 样品 分离胶 在PAGE中， 除了一般的电荷 效应外，还有凝 胶对样品的分子 筛效应和浓缩效 应， 三种效应共 同起作用， 使样 品的分离效果大 大提高。 （2） 等电聚焦电泳(IEF-PAGE) Ph=3 pH=10 连续pH梯 度的凝胶 和样品 电泳 两性电解质载体 ampholite （3） SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 在SDS和少量的巯基 乙醇存在时，蛋白质分子 解聚并处于完全展开的状 态，SDS以其烃基链与蛋 白质分子的侧链结合成复 合物，每两个氨基酸残基 相当于结合一个SDS分子 ，使得蛋白质分子在电场 中的迁移率完全取决于相 对分子量而同本身所带的 电荷及形状无关。 2. 离子交换层析 纤维素离子交换层析 交链葡聚糖离子交换层析 （三）根据对配基 的生物学特性的分 离： 亲和层析 亲和层析是利用 生物亲和力，即蛋白 质分子和其配基之间 特有的识别能力而建 立的一种纯化方法。 三、 蛋白质分子量的测定方法 1 . 根据化学组成测最低相对分子量 2 . 由渗透压测相对分子量 3 . 沉降分析法测相对分子量 沉降速度法： 蛋白质分子在离心力作用下沿旋转中心向外周方向 移动，产生沉降界面，通过测定界面的移动速度求出 蛋白质的分子量。 沉降平衡法： 蛋白质在高速离心力作用下逐渐沉降，直至其浮力 与离心力相等时为止。 4. 凝胶过滤法测相对分子量 在