色谱质谱分析法在医药卫生分析中的应用课件

色质联用分析法在医药卫生分析 中的应用 2012年8月 一、质谱仪器的原理及分类 质谱法（Mass Spectrometry） 通过将被测物质原子或分子离子化，利 用电磁学原理，对荷电粒子或碎片粒子依 其质量和电荷的比值（质荷比，m/z）进行 分离和分析，以达到确认其元素组成及分 子结构的目的。 一、质谱仪器的原理及分类 质谱法的特点 质谱不属波谱范围，质谱图与电磁波的波长和分子内 某种物理量的改变无关。 质谱是分子离子及碎片离子的质量与其相对强度的 谱, 谱图与分子结构有关。 质谱法进样量少, 灵敏, 快速，特异，化学计量 （Sensitivity，Speed，Specificity，Stoichiometry） 质谱是唯一可以给出分子量, 确定分子式的方法, 而 分子式的确定对化合物的结构鉴定是至关重要的。 一、质谱仪器的原理及分类 因质谱技术获诺贝尔奖的五位科学家 一、质谱仪器的原理及分类 MS：Mass Spectrometry, Mass Spectrometer 质谱仪的分类： (1) 有机质谱仪： - 气质联用，液质联用，傅立叶质谱仪，激光解吸 飞行时间质谱仪 (2) 无机质谱仪 - 电感耦合等离子体质谱, 同位素质谱仪，二次 离子质谱,氦质谱检漏仪 一、质谱仪器的原理及分类 质谱仪分析标准程序： （1）样品的导入 （2）样品的离子化 （3）被测离子进入电场或磁场 （4）离子按质荷比（m/z）进行分析 （5）按质荷比m/z.进行检测 一、质谱仪器的原理及分类 质谱图 以荷质比m/z为横座标，以对基峰(最强离子峰，规定 相对强度为100%)相对强度为纵座标所构成的谱图。 一、质谱仪器的原理及分类 质谱图 15 27 31 45 46 m/e 相对丰度 乙醇 有机质谱图 无机质谱图 一、质谱仪器的原理及分类 同位素质谱图 氯苯质谱图 溴丙烷质谱图 一、质谱仪器的原理及分类 质谱图 质谱在有机结构分析上的应用主要有两方面： 确定相对分子质量和分子式； 在低分辨质谱中，由分子结构与裂解方式的经验规律， 鉴定某些官能团，给出分子的结构信息； 定量模式：GC/MS SIM LC/MS/MS SIM or MRM ICP/MS SIM 一、质谱仪器的原理及分类 计算机控制系统 样品 导入 离子 源 质量 分析 放大 记录 检测 器 真空系统 GC HPLC ICP * 2005版起中国药典二部附录收载质谱法 一、质谱仪器的原理及分类 * 实现质谱技术的关键-高真空 离子源和质量分析器的压力在 104 105 Pa和105 106 Pa 或10-610-7mmHg和10-710-8mmHg * 仪器类型：机械泵+涡轮分子泵 Inlet Ion source Mass Analyzer Detector Data System High Vacuum System 一、质谱仪器的原理及分类 * 实现质谱技术的关键-高真空 -质谱是检测带电粒子,带电粒子在电磁场的作用下， 加速运动。如果有空气，带电粒子可能和空气中的其他 分子发生碰撞，使离子很快淬灭而达不到检测器，并引 起额外的离子分子反应，改变裂解模型，谱图复杂化 ，影响分离及检测。 一、质谱仪器的原理及分类 * 气质联用 一、质谱仪器的原理及分类 * 液质联用 单四极杆和串联质谱。 空间串联：QQQ、Q-Trap、Q-TOF、TOF-TOF 时间串联：Ion Trap、Orbitrap、FT-MS ESI APCI - API是液相色谱/质谱联用 仪最常用的离子化方式。 一、质谱仪器的原理及分类 * 电感耦合等离子体质谱 四极杆，双聚焦、飞行时间质谱 * 电感耦合等离子体质谱 二、质谱法在药品检验用的应用 * 液相色谱-质谱联用法 * 气相色谱-质谱联用法 * 电感耦合等离子体质谱：可进行定性、半定量、定量 分析及同位素比值的准确测量，还可与其他技术如HPLC、 HPCE、GC联用进行元素的形态、分布特性等的分析，广泛应 用于环境、半导体、医学、生物、冶金、石油、核材料分析 等领域。 * 气质联用：灵敏度高，适合于低分子化合物（分子量 气溶胶 -固体颗粒 -气体分子 -原子 -离子 汽化 去溶剂化 气化 原子化 离子化 ICP炬管 二、质谱法在药品检验用的应用 （1） 在化妆品检验中的应用 - 风险及限用物质：二噁烷、苯酚等 以二噁烷为例：SN/T 1784-2006 顶空气相色谱-质谱法： -顶空进样，交联5%苯基甲基硅烷毛细管柱 ，质谱检测器 下限2.5mg/kg 检测离子（m/z）离子相对丰度比（%）允许相对偏差（% ） 88100 58应用标准品测定离子相对丰度 比 20 43应用标准品测定离子相对丰度 比 25 二、质谱法在药品检验用的应用 （2） 在塑化剂检验中的应用 GB/T 21911-2008 含16中邻邻苯二甲酸 酯类酯类 增塑剂剂，不包含 邻邻苯二甲酸二异壬酯酯 DINP和邻邻苯二甲酸二 异癸酯酯DIDP. 二、质谱法在药品检验用的应用 （2） 在塑化剂检验中的应用 DIDP 1ppm DIDP 10ppm 二、质谱法在药品检验用的应用 液相色谱-质谱联用仪，LC/MS （1） 在药典中的应用 （3） 非法添加及有害残留检验中的应用 （2） 主成分及有关物质分析中的应用 （4） 基因工程药品检验中的应用 二、质谱法在药品检验用的应用 （1） 在药典中的应用 2010年版 中国药典一部收录三个品种 - 川楝子及苦楝皮中的川楝素进行含量测定 川楝素(Toosendanin): C30H38O11 MW.574.62 反相C18体系，乙腈-0.01%甲酸溶液（31:69 ）为流动相，采用单级四级杆质谱检测器，电喷 雾离子化（ESI）负离子模式下选择质荷比（m/z ）为573的离子进行检测。理论塔板数按川楝素计 算应不低于8000。通过外标法，以川楝素两个峰 面积之和计算川楝素的含量。 二、质谱法在药品检验用的应用 （1） 在药典中的应用 2010年版 中国药典一部收录三个品种 - 千里光中的阿多尼弗林碱进行了杂质检查 阿多尼弗林碱 Adonifoline C18H23NO7，MW= 365 具有细胞毒性 反相C18体系，乙腈-0.5%甲酸溶液（7:93） 为流动相,采用单级四级杆质谱为检测器，电喷雾离 子化（ESI）正离子模式下选择质荷比（m/z）为 366离子进行检测。理论塔板数按阿多尼弗林碱计 算应不低于8000。以百合碱为内标，计算校正因子 ，测定阿多尼弗林碱的含量。 二、质谱法在药品检验用的应用 在药典中的应用 USP32 - 血管升压素（Vasopressin ）: ESI+，1084（单电荷）和 543（双电荷）； - 人重组血清白蛋白（Recombinant Albumin Human）: 585个 氨基酸组成，分子量66,438 Da，ESI+多电荷质谱图去卷积， 20Da之内误差； - 醋酸去氨加压素（Desmopressin Acetate）: ESI+， m/z 1069，MS/MS，m/z 641、 742和 995子离子 。 二、质谱法在药品检验用的应用 * 药典中的定性鉴别（已知物的鉴别） 化学、红外、紫外、色谱保留时间 * 液质联用定性鉴别（未知物的鉴别） 色谱保留时间 (1) 一级质谱分子离子 (2) 二级质谱全扫描 (4) * EU guideline: 46 Identification points 一个多反应监测MRM (2) - 欧盟96/23/EC及2002/657/EC指令 - D,Hubert F, et.al，Trends in Analytical Chemistry, 2001, 20(8), 435 二、质谱法在药品检验用的应用 定性离子的分值 质谱技术IP / ion 低分辨率质谱 (LR-MS)1.0 低分辨率质谱LR-MSn 母离子1.0 低分辨率质谱(LR-MSn )Transition products1.5 高分辨率质谱(HR-MS)2.0 高分辨率质谱（HR-MSn ）母离子2.0 高分辨率质谱(HR-MSn) Transition products2.5 低分辨率质谱二级全扫描 (LR-MS Full Scan)4.0 二、质谱法在药品检验用的应用 相对强度的容许量 相对对丰度 (% 基峰) GC- MS/EI GC-MS/CI, GC- MS/MSn LC-MS, LC-MS-MSn 50 % 10 % 20 % 20 % - 50 % 15 % 25 % 10 % - 20 % 20 % 30 % 10 % 50 % 50 % 二、质谱法在药品检验用的应用 相对强度的容许量 20 % 20 % 25 % 30 % 50 % 二、质谱法在药品检验用的应用 盐酸洛美沙星光降解分析 二、质谱法在药品检验用的应用 新生儿筛查主要是针对： v先天性甲状腺功能低下（服用甲状腺激素可 以完全避免痴呆的发生）； v苯丙酮尿症（只要不服用含有苯丙氨酸的包 括人奶在内的食品就可以完全避免痴呆的发 生）； v半乳糖血症（只要不服用含有乳糖的包括人 奶在内的食品就可以完全避免痴呆的发生） 。 应用LC/MS/MS可临床检测30多种遗 传性代谢失常疾病如 v各种氨基酸代谢失常血症包括同构胱氨酸尿 症、瓜氨酸血症、酪氨酸血症、超苯丙氨酸 血症、精氨酸酶缺乏症、精氨琥珀酸尿症和 各种超甲硫氨酸血症；短链和长链酰基辅酶 A脱氢酶缺乏症(SCAD和LCAD)、异戊酸血 症、丙酸血症、甲基丙二酸血症、戊二酸血 症和其它各种有机酸代谢失常疾病等。 用电喷雾串联质谱分析苯丙酮尿症 (PKU) 药物代谢结合物的测定 葡萄糖苷酸及硫酸盐结合物 生物大分子的分子量测定 胸腺五肽ESI质谱图 电喷雾电离质谱监测药物 Ractopamine的合成 合成化合物C的ESI-MS (+Q1) 合成化合物C的MS/MS 盐酸洛美沙星光降解分析 ABC A M+H 308.0M+H 308.0 B M+H 294.3M+H 294.3 C M+H 368.0M+H 368.0 二、质谱法在药品检验用的应用 非法添加及有害残留检验中的应用 2006年3月，SFDA通用补充检验方法及项目的批准 - 治疗肥胖症中成药（SFDA2006004） 麻黄碱、芬氟拉明、西布曲明 - 治疗消渴症中成药（SFDA2006005） 苯乙双胍、格列吡嗪、格列本脲 - 消肿止痛类中成药（SFDA2006006） 双氯芬酸、氨基比林 - 止咳平喘类中成药（SFDA2006007） 茶碱 - 镇静安神类中成药（SFDA2006008） 地西泮、氯硝西泮 - 镇静安神类中成药（SFDA2006024） 艾司唑仑 - 补肾壮阳类中成药（SFDA2006009） 西地那非、他达拉非 二、质谱法在药品检验用的应用 （3） 非法添加及有害残留检验中的应用 UV 235nm UV 254nm (+) ESI-MS (-) ESI-MS 八种降糖药液质联用方法的建立 二、质谱法在药品检验用的应用 （3） 非法添加及有害残留检验中的应用 * 糖皮质激素的基本结构中 均具有环戊烷骈多氢菲母核 ，其中C3的酮基、C20的羰 基及C4-5的双键是保持生理 功能所必需，结构上可通过 在C12引入双键，在C6、 C9、 C16 、C21引入结构修 饰基团来增强其抗炎作用， 减弱水盐代谢作用。 M1+准分子离子峰： 泼尼松龙 m/z361.2 泼尼松 m/z359.3 地塞米松 m/z393.2 醋酸可的松 m/z403.2 醋酸泼尼松龙 m/z403.2 醋酸泼尼松 m/z401.3 醋酸地塞米松 m/z435.1 二、质谱法在药品检验用的应用 （3） 非法添加及有害残留检验中的应用 糖皮质激素类药物 HPLC-UV MS色谱图 （a）七种糖皮质激素对照品；（b）供试品 * 以泼尼松计算，柱上灵敏度达到0.5ng 二、质谱法在药品检验用的应用 基因工程蛋白药物中抗生素残留检测 M+H=349.8 -H2O -COOH -CO 氨苄西林MS/MS Conv.= 0.0525g/mL， 0.5ng（10L）， SN4 二、质谱法在药品检验用的应用 食品中氯霉素的残留检测 HPLC & MRM（ODS，MeCN-H2O，Gradient program） ESI(-)， Q1=321,Q3=152, 194 and 257 TIC 321-152 321-194 321-257 C11H12Cl2N2O5 FW=323.13 二、质谱法在药品检验用的应用 食品中氯霉素的残留检测(样品) 二、质谱法在药品检验用的应用 增塑剂检测 定性方法重复： C18 C4 HPLC/MS/MS： Merck LiChroCART RP-18e C18，5 m，2.0 125 mm， 5%乙酸铵-95甲醇梯度淋洗 HPLC/MS/MS： VyDAC 214MS C4， 5 m，2.0 150