基因工程原理与技术

第六章 DNA 体外重组与重组分子导入受体细胞 DNA体外重组是指目的基因DNA片段与适当载体在DNA 连接酶的作用下连接形成重组DNA分子的过程。 第一节 重组DNA分子的构建 一、DNA体外重组必须考虑的因素： 实验步骤简单易行； 连接效率较高； 选择载体要易于重组子筛选； 选择的连接方式要便于回收插入的外源DNA片段； 外源基因必须在表达载体DNA的启动子控制之下，并 置于正确的阅读框架之中。 二、外源基因片段与载体的连接方式 1、黏性末端连接法(黏性末端法) 单酶切黏性末端连接法 优点：实验操作简单，易 于回收外源DNA片段。 缺点：a、载体易自身环 化； b、克隆不定向；c、 难插入特定的基因(两端具 有不同酶切位点)；d、大 片段DNA的重组率较低； e、片段间串联连接，给筛 选和分析带来困难。 插入式黏性末端连接法 碱性磷酸酶处理线性DNA载体防止载体自身环化 双酶切黏性末端连接法 (取代式黏性末端连接法) 优点：克服单酶切黏性 末端连接法的缺点，能定向 克隆。但实验操作烦琐。 同尾酶黏性末端间连接 ：产生杂合位点，不易酶切 回收插入片段。但在制备载 体DNA片段时不需除去限制 酶就可进行连接，防止载体 的自身环化。 构建基因组文库常使用 同尾酶Sau3AI和BamHI 2、平头末端连接法(平头末端法) 缺点：连接效率低； 底物浓度高、酶使用浓度高。 加低浓度PEG可促进连接效率。不易回收插入DNA片段 ；双向插入；多拷贝插入(高底物浓度)。 DNA衔接头法(衔接头法) 衔接头(adaptor)：人工合成的一端为 平头末端、另一端为某种限制内切酶 的单链黏性末端的DNA片段。 连接子除用于DNA体外重组连接外，还用于插入突变。 第二节 重组DNA分子导入受体细胞 转化(transformation)是指将质粒载体的重组DNA分子引 入受体细胞的过程。 转染(transfection)是指将噬菌体载体或病毒载体的重组 DNA分子引入受体细胞的过程。 一、重组DNA向细菌细胞转入 1、感受态细胞热激转化法(化学转化法?) 感受态细胞是指处于能摄入外源 DNA的这种生理状态的 细胞。 导入方式：42热激4590s 转化效率：105106转化子/g 2、电击转化法(高压电穿孔法) 原理：将受体细胞置于一个适当的外加电场中，利用高 压脉冲对细菌细胞的作用，使细胞表面形成暂时性的微孔 ，质粒DNA得以进入细胞质内，但细胞不会受到致命伤害 ，一旦脱离脉冲电场，被击穿的微孔即可复原。 影响因素：电压大小(300600V/cm)；脉冲时间(20 100 ms)；重组DNA量。 特点：操作简单，不需制备感受态细胞，适用于任何菌 株。但需要昂贵的仪器设备。 转化效率：1091010转化子/g 二、外源DNA向真核细胞转入 1、载体介导外源DNA转移(载体介导基因转移) 病毒载体、质粒载体 2、外源DNA直接转移(基因直接转移) 磷酸钙沉淀法(DNA/磷酸钙共沉淀法) 原理：DNA溶液与适量的CaCl2溶液混合，再加入一定 量的磷酸盐溶液，逐步生成DNA-磷酸钙沉淀复合物。将适 量的DNA-磷酸钙沉淀加入细胞培养液中，通过细胞的胞饮 作用进入细胞质或进而转移到细胞核内，然后整合到染色体 上，或游离于细胞质中逐渐被降解。 影响因素：a、沉淀中的DNA浓度，加受体DNA可提高 转化效率；b、沉淀与细胞的保温时间。 脂质体介导法 脂质体是磷脂在水中形成的一种由脂类双分子层围成的 囊状脂质小泡结构，其大小一般为15um。 原理：脂质体与细胞膜之间发生融合，便把其携带的外 源DNA转入细胞内或进入细胞核，最终实现基因的转移。 脂质体介导法的转染效率可达到磷酸钙沉淀法的5100倍 ，但比DAEA-葡聚糖法低至少90。 优点：脂质体制备程序简单、可进行常规消毒灭菌、毒 性小、包装容量大以及保护DNA免受核酸酶的降解等。 缺点：效率低。 DEAE-葡聚糖法 DEAE-葡聚糖是一种高分子多聚阳离子化合物，能与 外源DNA结合成复合物，然后通过细胞的胞吞作用使DNA 进入细胞而实现基因转移。 血影细胞介导法 血影细胞是指哺乳动物的红细胞在机械作用、病毒诱导 、低渗等条件下发生溶血，使血红蛋白大量溢出，最后形 成仅有细胞膜包被的细胞结构。 让携带外源DNA的血影细胞与受体细胞在适当条件下 发生细胞融合，从而将外源DNA导入受体细胞。 此外，电击法、基因枪法、PEG法、精子介导法、花 粉管通道法、微注射法 第七章 重组子(转化子或克隆)的筛选与鉴定 重组子是指目的DNA片段与载体连接形成重组DNA分子。 转化子(转化体、克隆)是指导入外源DNA后获得了新的遗 传标志的受体细胞或由此而来的组织、生物体。 PCR筛选 菌落/噬菌斑杂交 抗性标记筛选 蓝白斑筛选 噬菌体包装容量的正筛选 Spi-正筛选 重组子筛选 直接筛选 目的基因筛选 载体筛选 其他方法(报告基因) 间接筛选 Western blotting Northern blotting 重组子鉴定 第一节 遗传学筛选法 一、根据载体表型特征的筛选(选择标记) 简单、快速、效率高。也称为平板筛选法 1、抗药性标记插入失活筛选法 转移 Ampr Tetr 外源DNA Ampr Tetr 体外连接 Ampr Tets 转化 感受态E.coli 涂平板 Amp平板 Tet平板 环丝安酸+Tet 培养基 2、-半乳糖苷酶显色反应筛选法(-筛选或蓝白斑筛选) 二、根据插入基因遗传性状的筛选 1、抗性基因 抗生素抗性基因 2、功能互补筛选法 例如：营养缺陷突变菌株 第二节 依据核酸分子的筛选-检测法 一、菌落/噬菌斑印迹杂交 重复筛选、效率高、可靠性强 二、斑点印迹杂交 简单、迅速 三、Southern印迹杂交 主要用于重组子鉴定，能检测出插入片段的重排。 四、Northern 印迹杂交 重组子的检测鉴定 五、PCR筛选-检测法(菌落/噬菌斑PCR法) 快速、简便、经济、高效 六、测序检测法 第三节 物理检测法 一、直接凝胶电泳检测法 重组DNA分子 载体DNA分子 二、限制酶酶切片段分析检测法 阳性克隆：7、8、 10、11、13、14，但 第10号为外源DNA片 段串联插入的克隆； 假阳性克隆：4、5 、6