蛋白样本制备及定量、western blot课件

Company LOGO 蛋白样本制备与Western Blot 主要内容 蛋白样本制备的目的蛋白样本制备的目的1 蛋白样本制备总体原则和策略蛋白样本制备总体原则和策略2 案例分析案例分析细胞总蛋白的提细胞总蛋白的提取取3 成功的 Western Blot6 蛋白提取产品选择指蛋白提取产品选择指南南4 蛋白定量方法的选蛋白定量方法的选择择5 一 蛋白样本制备-成功蛋白分析的基础 蛋白样本 activity assays protein microarrays SDS-PAGE /IEF immunoblotting mass spectrometry 2-DE2-DE EMSA ELISA 蛋白样本制备的目的: 后续应用 二 蛋白样本制备的原则 蛋白 样本 制备 原则 方法应具备标准化，具有重现性 、可靠性、简便性； 尽量抽提完全； 应使所有蛋白全部处于溶解状态 防止发生蛋白的降解、聚集、沉淀、变性 防止在抽提过程中发生化学修饰 如做2D则需去除高丰度蛋白或无关蛋白 必要时去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 二 蛋白样本制备的策略 制备蛋白的目的 活性分析 免疫印迹杂交 免疫沉淀或共沉淀 1D 2D EMSA CHIP等 实验材料 细胞 组织 固定组 织或石蜡包埋组织 微 生物 酵母 植物 提取 RNA后的剩余的蛋白 样本等 目的蛋白的结性质 与分布 分布于胞桨/胞核/ 膜 可溶/不可溶 含 量多少 分子量大小 四级结构特征 磷酸 化等修饰 方法的选择 1 自行配制抽提试剂, 根据文献方法或经验提取 2 购买商品化试剂盒, 按其说明书的方法提取 三 案例分析- 细胞中总蛋白的制备 高速离心收集高速离心收集 上清即得全蛋上清即得全蛋 白样本白样本 细胞加入裂解细胞加入裂解 液冰上放置液冰上放置1010 -15-15分钟分钟 蛋白定量和蛋白定量和 SDS-PAGESDS-PAGE 检测检测 裂解样品离心收集定量检测 细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点 表面活性剂缓冲液 蛋白酶抑制剂 磷酸酶抑制剂 其它：H2O、NaCl、等 还原剂 RIPA Buffer 细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点 缓冲液 Tris-HCl（pH7.5),提供pH环境，使蛋白保持稳定， 增加溶解性。 细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点 表面活表面活 性剂性剂 溶解膜与脂膜，溶解与稳定蛋白质（特别是膜蛋白） 分为离子型（如SDS、脱氧胆酸盐等）和非离子型（ 如NP-40、Triton-100、tween系列等）。 各类表面活性剂特点 1 阴离子型: SDS 脱氧胆酸盐 2 阳离子型: CPB和CTAB 3 双性离子型: CHAPS Zwittergent系列 4 非离子型: Brij系列 Triton-100 Nonidet P40 Tween 系列等 选用表面活性剂考虑的因素 参考文献报告保持生物活性时使用的表面活性剂 选 用 表 面 活 性 剂 考 虑 的 因 素 工作条件下表面活性剂的溶解性 使用分子生物学级的表面活性剂,无核酸酶蛋白酶等 根据样本下游的应用来选择表面活性剂的种类 考虑表面活性剂的去除方法 表面活性剂的纯度影响提取蛋白的质量 保护蛋白活性时,不仅考虑表面活性剂的种类还有浓度 尽量使用毒性较低的表面活性剂 因不明原因某些蛋白适用专门的表面活性剂进行分离 使用非表面活性剂NDSB结合表面活性剂来增加膜蛋白溶解性 有时比较难仅一种表面活性剂既能溶解蛋白又适用于蛋白分析, 常先用一种表面活性剂将蛋白溶解,而另一种表面活性剂取代进 行蛋白的后续分析 去除未结合的表面活性剂 1 疏水吸附方法 Hydrophobic Adsorption 2 透析法 Dialysis 3 凝胶层析法 Gel Chromatography 4 离子交换层析 Ion-exchange Chromatography 根椐表面活性剂的疏水性,CMC,凝聚数目,和电荷等性质来去除. 细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点 蛋白 酶抑 制剂 抑制蛋白酶的活性，防止蛋白被水解，使用前临 时加入 蛋白酶抑制剂及其鸡尾酒 细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点 磷酸 酶抑 制剂 抑制磷酸酶的活化，防止蛋白样本脱磷酸化，使 用前临时加入。 磷酸酶抑制剂选择 磷酸酶主要包括非特异性的磷酸酶（例如：碱性磷酸酶 ，酸性磷酸酶），特异性的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶（例如 ：PP1, PP2A, PP2B） 、酪氨酸蛋白磷酸酶（例如： PTP）。 常规的抑制剂主要包括： 试剂 名称抑制作用 氟化钠酸性磷酸酶，丝氨酸/苏氨酸磷酸酶 正钒酸钠碱性磷酸酶，酪氨酸蛋白磷酸酶 焦磷酸钠丝氨酸-苏氨酸磷酸 细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点 还原剂还原剂 防止蛋白质发生氧化，保护二硫键。DTT、 巯基乙醇等。. 细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点 其它其它 水；溶剂 NaCl： 全蛋白抽提时注意事项 可以适量加入甘 油,稳定蛋白 注意事项 可以适量加入 Benzonase /DNase I等核酸 酶,去除DNA,充 分提取蛋白,降 低提取的粘度. 抑制蛋白酶及磷 酸酶 使用的 Detergent的种 类 纯度 浓度 干 扰 去除等因素 Temperature 试剂和器皿冰上 预冷,低温4操 作 细胞或组织的样 本量 裂解液的用量 细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点 四 蛋白样本制备产品选择指南 核蛋白样本制备 抽提原理抽提原理 低渗裂解细胞膜低渗裂解细胞膜, ,释放出胞浆蛋白释放出胞浆蛋白 与胞核与胞核; ; 离心分离出胞核离心分离出胞核; ; 高渗破裂胞核高渗破裂胞核, ,释放出可溶性核蛋释放出可溶性核蛋 白白; ; 加核酸酶降解加核酸酶降解DNA,DNA,释放出释放出DNADNA结结 合蛋白合蛋白( (组蛋白和转录因子组蛋白和转录因子) ) 实验注意事项实验注意事项 试剂和器皿冰上预冷试剂和器皿冰上预冷 裂解液的用量裂解液的用量 细胞总量细胞总量 抑制蛋白酶抑制蛋白酶 蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂 膜蛋白样本制备 膜蛋白的抽提 v 方法及原理 方法多 直接抽提法 分级抽提法 1:先机械法等非表面活性剂方法裂解细胞,再用表面活性剂抽提 2:按溶解性分级抽提 3:按亚细胞分级抽提 v 产物 细胞膜蛋白 细胞器质膜蛋白 v 注意事项 根椐膜蛋白种类和后续研究目的的不同,选择不同的产品或表面活性剂 变性剂等. 抑制蛋白酶. 样本量 膜蛋白的直接提取 蛋白的分级提取 按蛋白溶解度不同进进行分级级抽提,降低样样品的复杂杂性并富集低丰度蛋白质质 第一步：用非表面活性剂溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白； 第二步：把未溶解的pellet用裂解液溶解,提取高疏水性蛋白(膜蛋白)； 第三步：用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后抽提前两次抽提后 不能溶解的膜蛋白约占整个样品的11%（W/W）。 亚细胞分级抽提 v 用超离心技术术分离出细细胞器 、质质膜和细细胞核等成分，再 用适当的蛋白质质溶解液进进行 溶解。其优优点是不仅仅大大减 少样样品的复杂杂性，而且可对对 分离的蛋白质进质进 行亚细亚细 胞 定位。但该该法需要专业仪专业仪 器，有时时会出现现假阳性。 v 根椐胞浆浆/胞膜/胞核/骨 架蛋白的亚细亚细 胞策略用 不同提取液逐级级溶解 四种亚细胞组分分离提取的结果 线粒体蛋白样本制备 v 首先用密度梯度离心方法分别别分 离出线线粒体,胞质质,胞核. v 再用线线粒体抽提Buffer溶解线线粒 体蛋白. 其它蛋白抽提产品 v高丰度蛋白去除试剂盒 v信号蛋白提取试剂盒 v糖蛋白提取试剂盒 v细菌蛋白提取试剂盒 v酵母蛋白提取试剂盒 v植物蛋白提取试剂盒 五 蛋白定量产品选择指南 BCA法蛋白定量 BCA（bicinchoninic acid）是理想的蛋白质质定量方法 。该该方法因快速灵敏、稳稳定可靠，对对不同种类类蛋白质质 检测检测 的变变异系数非常小而倍备备受专业专业 人士的青睐睐。该该 方法的原理是，在碱性条件下，蛋白将Cu2+还还原为为 Cu+，Cu+与BCA试剂试剂 形成紫色的络络合物，测测定其在 562nm处处的吸收值值，并与标标准曲线对线对 比，即可计计算待 测测蛋白的浓浓度。BCA法测测定蛋白浓浓度不受绝绝大部分样样 品中的化学物质质的影响。在组织细组织细 胞裂解实验实验 中，低 浓浓度的去垢剂剂SDS，Triton X-100，Tween不影响检测检测 结结果，但螯合剂剂（EDTA，EGTA）、还还原剂剂（DTT， 巯巯基乙醇）和脂类类会对检测结对检测结 果有一定影响。实验实验 中 ，若发现样发现样 品稀释释液或裂解液本身背景值较值较 高，可试试 用Bradford法测测定蛋白浓浓度。 Bradford法蛋白定量 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合， 使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为 ，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸 ）和芳香族氨基酸残基相结合。测定快速、简便，只需 加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右 。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可 完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20 分钟之间，颜色的稳定性最好。由于各种蛋白质中的精 氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于 不同蛋白质测定时有较大的偏差。去污剂、 Triton X- 100、十二烷基硫酸钠（SDS）干扰此法的测定。 Lowery法蛋白定量 Lowry法蛋白质测质测 定法是最灵敏的方法之一。过过去此法 是应应用最广泛的一种方法，在碱性条件下，蛋白质质中的 肽键肽键 与铜结铜结 合生成复合物。 Folin酚试剂试剂 中的磷钼钼酸 盐盐磷钨钨酸盐盐被蛋白质质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还还 原，产产生深兰兰色（钼兰钼兰 和钨兰钨兰 的混合物）。在一定的 条件下，兰兰色深度与蛋白的量成正比。这这个测测定法的 优优点是灵敏度高，缺点是费时间较长费时间较长 ，要精确控制操 作时间时间 ，标标准曲线线也不是严严格的直线线形式，且专专一性 较较差，干扰扰物质较质较 多。 六 成功的Western Blot Diagram 通过电泳区分不同的组分 ，并转移至固相支持物， 通过特异性试剂（抗体） 作为探针，对靶物质进行 检测，蛋白质的Western 印迹技术结合了凝胶电泳 的高分辨率和固相免疫测 定的特异敏感等多种特点 ，可检测到低至15ng （最低可到10100pg） 中等大小的靶蛋白 原理 六 成功的Western Blot 二抗孵育 蛋白提取与定量 一抗孵育 封闭 转膜 SDS-聚丙烯酰胺电泳 蛋白变性 显影 蛋白变性 Tris-cl(PHTris-cl(PH 6.8) 6.8) SDS SDS Glycerol Glycerol B Bromphendromphend-blue -blue -巯基乙醇巯基乙醇 DTTDTT 高温变性高温变性, ,形成形成蛋 白质-SDS胶束 急速冷却，防止复性急速冷却，防止复性 加入 Sample buffer 沸水浴15min冰浴30min SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 产物：三维网状结构凝胶 加速剂 催化剂 单体 交联剂 缓冲液缓冲液Tris-ClTris-Cl 四甲基乙二胺（TEMED） 丙烯酰胺（Acr） 过硫酸胺或核黄素（AP）甲叉双丙烯酰胺（Bis） SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 作用缓冲液PH凝胶浓度 浓缩胶使蛋白样品浓缩PH6.8Tris-Cl 低，2-5% 分离胶使蛋白样品分离PH8.8Tris-Cl 高，根据蛋白 大小 电泳缓冲液：PH8.3Tris-甘氨酸-SDS系统。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶最佳分离范围 不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。 聚丙烯酰胺分离胶配方 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 灌制分离胶 隔绝空气 灌好后一般室温放置3040分钟 SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓缩胶配方 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 灌制积层胶 插入梳子 SDS-PAGE胶制备注意事项 v过硫酸铵一般现配现用，如连续实验可在4度放 置23天。配制30丙烯酰胺储存液要过滤。 v配制过程中每加入一种试剂要充分混匀，防止 胶出现浓度不均的情况。 v要根据温度调整TEMED的使用量。 v水封的时候水要慢慢加入，太快会导致胶面不 平。 v插梳子的时候要用力均匀，一次成型。 v在上样前可20V恒压预电泳20分钟，可去除泳道 中的杂质。 上样及电泳 v提前将样品沸水浴5分钟，12000 14000rpm离心5分钟。 v根据自己的设计上样。 v80V恒压跑浓缩胶。 v看溴酚蓝压缩成一条线后把电压调为 100V。 v当溴酚蓝跑至离胶的下面还有0.4 0.6mm时停止电泳。 转膜 蛋白质带负电荷，凝胶在负极一侧，膜在正极 一侧，接通电源以后，蛋白质由负极向正极转 移至膜上。 转膜 转膜注意事项 v PVDF膜要预先用甲醇活化；NC膜要预先泡水，除去中间的气泡。 然后在转膜也中平衡20分钟。 v 膜、胶、滤纸夹好后要将中间的气泡全部赶出来，否则有气泡的地 方就会断路，蛋白无法转到膜上。 v 转膜要在冰浴中进行，防止散热量太大导致转膜温度过高。 v 根据蛋白分子量大小选择适合的转膜条件。 分子量（kd） 转膜条件 200同上，可在转膜液中加0.1SDS 膜的封闭 为避免膜与作为检测试剂的特异性第一抗体发生非特异性结合，使非特异 性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理,一般用5的脱脂奶 粉或者3的BSA室温或37度封闭2小时。 转好蛋白的膜 ProteinProtein 封闭 Protein Protein Blocking AgentBlocking AgentBlocking Agent 一抗孵育 Protein Protein Blocking AgentBlocking AgentBlocking Agent Primary Antibody 二抗孵育 Protein Protein Blocking AgentBlocking AgentBlocking Agent E E E E Primary Antibody Secondary Antibody 显影 Protein Protein Blocking AgentBlocking AgentBlocking Agent E E E E Primary Antibody Secondary AntibodyEnzyme (E) s s s s s P P P P Substrate 显色方法- HRP酶促底物直接显色 显色方法化学发光 SuperSignal West Pico 化学发光底物 SuperSignal West Femto超灵敏型底 物 SuperSignal West Femto增强型底物 主要优点 与ECL 系统相比减半 的价格、双倍的信 号 适用于HRP检测的最 灵敏的化学发光 底物 延长的信号持续时间使 这种底物用于今天 的成像设备最为理 想 检测下限 10-12g10-15g 10-14g 信号持续时间6-8小时8小时24小时 首选检测方法X胶片成像设备或X胶片成像设备或X胶片 建议一抗稀释 度 1:1000-1:50001:5,000-1:100,0001:1000-1:50,000 建议二抗稀释 度 1:20,000-1:100,0001:100,000-1:500,0001:50,000-1:250,000 产品保存期室温1年41年或室温6个月室温1年 建议印迹膜硝化纤维硝化纤维或PVDF硝化纤维或PVDF 成功的要素 n质优量足的蛋白样本 n科学的对照 n正确的抗体选择 保存和使用 n细致的实验操作 n步步监测 科学的对照 v 蛋白Marker：预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋 白的大小和示踪 v 阳性对照：目的蛋白或明确表达目的蛋白的组织或细胞的蛋白提取 物，用于检验整个实验体系和过程的正确性有效性/特别是一抗的质 量和效率 v 阴性对照：非目的蛋白或明确不表达目的蛋白组织或细胞的蛋白提 取物，用于检验抗体的特异性 v 二抗对照：不加一抗，用于检验二抗的特异性 v 内参对照：管家基因编码的、很多组织和细胞中都稳定表达的蛋白 ，用于检测整个WB实验过程及体系是否正常工作，并作为半定量 检测目的蛋白表达量的标准对照 v 空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果 蛋白Marker WB常用内参及其技术参数 antibody AC-15 (ab6276) at 1/5000 dilution, Lysates/proteins at 20 ug per lane Lane 1 : HeLa nuclear Lane 2 : HeLa