基因工程中常用的工具酶.ppt

二、基因工程的基本程序 载体质粒 外源DNA片段外源DNA插入 剪切 引入宿 主细胞 选出含有重 组DNA的细 胞扩增表达 a b b A A b 第二章 基因工程中常用的工具酶 第一节 限制性核酸内切酶与DNA 分子的体外切割 第二节 DNA连接酶和DNA分子的 体外连接 第三节 其他工具酶 第一节 限制性核酸内切酶与DNA 分子的体切割 限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链 DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切 割DNA双链结构的核酸内切酶。 l一、寄主控制的限制与修饰作用如图2-1，图2- 2 l二、限制性核酸内切酶的制备方法 l三、限制性核酸内切酶分类和命名 l四、型限制性核酸内切酶的基本特性 l五、影响限制性内切酶活性的因素 分类： ：识别和切割位点不固定，随机性。 ：核酸内切酶活性和甲基化活性是 不分开的。 ：能在识别位点处切割DNA，切割位 点固定。核酸内切酶活性和甲基化活性 是分开的。常用。 四、型限制性核酸内切酶的基本特性 识别序列 ：1.47个核苷酸组成的特定核苷酸序 列 2.回文结构：两个顺序相同的拷贝 在DNA链上呈反向排列。 EcoR 5 -G AATTC-3 3 -CTTAA G-5 l经限制酶切割后的位点,DNA断裂类型 1.粘性末端 (1)3-OH单链延伸的粘性末端.如：Pst 5-CTGCA G-3 5-CTGCA G-3 3-G ACGTC-5 3-G ACGTC-5 (2)5-P单链延伸的粘性末端.如：EcoR 5-G AATTC-3 5-G AATTC-3 3-CTTAA G-5 3-CTTAA G-5 2.平末端 如:Sma 5-CCC GGG-3 3-GGG CCC-5 两种特殊的限制酶 (1)同尾酶 识别位点不同，酶切后产生同样的粘性末段的 两种酶。如：BamH 和Bgl (2)同裂酶 识别序列相同，对甲基化切点敏感性不同的两 种酶 。如:Mbo 和Sau3A共同识别序列GATC ，但对 GmeATC切点,前者不能切，后者能切。 l五、影响限制性内切酶活性的因素 l1.DNA的纯度 l2. DNA的甲基化 l（1）基因工程使用失去甲基化酶的大肠杆菌 l（2）研究基因工程DNA的甲基化程度 l（3）改变限制酶的识别特性 l3.温度 l4.分子结构 l5.限制酶的缓冲液 l星号活性 lEcoR切 GAATTC EcoR*切 pupuATpypy 或AATT 第二节 DNA连接酶和DNA分子的 体外连接 l一、DNA连接酶 DNA连接酶（Ligase）是一种能 够催化在双股DNA链的3-OH和5-P 之间形成磷酸二酯键的酶，可连接互 补粘性末端或平端以及缺口修复，不 能连接单链DNA或裂口. 温度 l二、DNA分子的体外连接 二、DNA分子的体外连接 l1粘性末端DNA片段的连接和单切点的 磷酸化 l2平末端DNA片段的连接 l（1）T4DNA连接酶法 l（2）同聚物加尾法 l（3）用化学合成的衔接物连接DNA分子 第三节 其他工具酶 l一、大肠杆菌DNA聚合酶 l二、DNA聚合酶大片段（Klenow酶） l三、T4DNA聚合酶 l四、逆转录酶 l五、末端脱氧核苷酰转移酶 l六、核酸酶S1 l七、核酸酶BAL31 l八、外切核酸酶 l九、T4多聚核苷酸激酶 l十、碱性磷酸酶 l十一、 甲基化酶 命名 Hind H: Haemophilus 嗜血杆菌属 in: influenzae 流感 d: Rd株 ：该菌株中第三个被分离到的限制酶 同尾酶BamHI和BglII AGATCT GGATCC TCTAGA CCTAGG Bgl BamHI A GATCC TCTAG G T4连接酶 AGATCC （连接后的切点均不能被上述两种酶切 ） TCTAGG 一、大肠杆菌DNA聚合酶 l1.三种活性 l（1）5-3聚合酶活性（在有dNTP时） l（2）3外切酶活性 （无dNTP时大亚基活性） l（3）5外切核酸酶活性（无dNTP时小亚基活 性） l2.在基因工程中的应用 ：缺口平移标记技术 。 二、DNA聚合酶大片段（ Klenow酶） l1.DNA聚合酶活性 （切除小亚基，保留大亚基） l2. 3外切酶活性（无dNTP时） l3. 在基因工程中的应用 l（1）标记粘性末端. -32PdNTP l 标记平末端 -32PdNTP l（2）将5端伸出的末端填平 l （3）可用来反转录合成双链cDNA。 l（4）补平粘性末端。 三、T4DNA聚合酶 l具有5-3聚合酶活性和3-5外切酶 活性。其外切酶活性比E.coli DNA聚合酶 I的活性高200倍。 取代反应 四、逆转录酶 逆转录酶可以RNA为模板，逆转录成cDNA 第一链，又称依赖RNA的DNA聚合酶。 1.聚合酶活性 RNA或DNA为模板 2. 3外切酶活性 能使DNA-RNA杂合链中的 RNA降解。 应用： l1.RT-PCR 使mRNA逆转录成cDNA l2.制备探针。 五、末端脱氧核苷酰转移酶 l可催化DNA片段上的3-OH端加接脱氧 核糖核苷酸。 l常用于同种碱基多聚体接尾反应 l核素标记DNA片段的3端 六、核酸酶S1 可以降解单链DNA和RNA l(1)将DNA切成平末端。有些限制性内切核酸酶 可以将DNA切成粘性末端，经过核酸酶S1降解 可切除DNA末端的单链。生成平末端DNA。 l(2)切除cDNA中单链发夹状结构。反转录反应 合成的cDNA，可能形成单链发夹状结构，为 了得到平末端cDNA可用核酸酶S1分解，生成 无发夹结构的cDNA。 l(3)可用核酸酶S1分析DNARNA杂交分子的结 构。 十、碱性磷酸酶 l该酶的功能是以单链或双链的DNA、 RNA为基质，将DNA或RNA片段5端 的磷酸切除，产生5-OH。 l应用： (1)用该酶催化切除DNA或RNA5端的磷酸, 然后加上-32P-NTP在DNA多聚核苷酸激酶 的作用下标记5端。 (2)用于避免单酶切后质粒自我环化。 十一、 甲基化酶 l常见的有dam甲基化酶和dcm甲基化酶， 可使相应碱基甲基化。dam可在限制酶识 别的5GATC3 或5GAAT3 序列的5腺嘌 呤N6位上引入甲基。dcm可在限制识别的 5CCAGG3 或5CCTGG3 序列的5胞嘧 啶引入甲基。常用于使酶切位点中的碱 基甲基化而避免降解，保护酶切位点。 核酸酶BAL31 从线形DNA分子两端（粘端/平端）以渐进方式切去单核 苷酸，以形成寡聚核苷酸或制造末端缺失。此外也有类似于SI 酶单链特异降解活性，可除去粘性末端或单链发夹结构。 外切核酸酶 能从线性DNA的3-OH末端沿3 5方向切去单核苷酸， 制造3 端缺失，制备DNA模板或