《糖生物学基础理论》PPT课件.ppt

糖、聚糖、糖复合物糖、聚糖、糖复合物 （研究生班）（研究生班） 第二军医大学 生物化学与分子生物学教研室 2003年9月10日 序 言 一、糖生物学（glycobiology）正在成为生命 科学的新前沿 二、糖基化作用（glycosylation）与糖化作用 （glycation） （一）“糖生物学”概念的提出： 1988年 Dwek R. A（牛津大学教授） Annu Rev Biochem 1988;57:785-838 Glycobiology. Rademacher TW, Parekh RB, Dwek RA. Department of Biochemistry, University of Oxford, England. Publication Types: Review Review, Academic 糖生物学是以糖链为“生物信息分子”的水平上 阐明多细胞生物的高层次生命现象的一门学科。 G. W. Hart（美国著名糖生物学家 ）： “生物化学中最后一个广袤前沿 糖生物 学的时代正在加速来临。” （1993年5月 在美国旧金山召开的首届国际糖生物学工程会议 “人类疾病的新前景” （1993年9月 美国NIH召开首届糖生物学会议） “糖生物学是生物化学和生物医学交叉点的 新前沿” （1994年 美国第二届糖生物工程会议） （二）糖生物学研究中的一场革命 1990年11月，3个不同研究小组几乎同时发现血管 内皮细胞-白血球粘附分子（ELAM-1，后改称为E-选 择素，E-selectin），这种分子能识别白血球表面唾液 酸化四聚糖 sia-Lex（ Sia-Gal-Fuc-GlcNAc ）， 它是 一种血型抗原。 这是首次真正在人体内确证了炎症过程有糖类和 相关的糖结合蛋白参与。 更令人吃惊的是 在肺癌细胞和结肠癌细胞表面也发现同样的四糖（ sia-Lex）。可能同样的机制导致肿瘤的转移。 继之，产生以该研究成果被产业化的热潮，“糖工 程”（glycotechnology）也运应而生。 “糖工程” 研究的是糖生物学的方法论和基本技术 ，以及把基础研究获得的知识进一步转化为生产技术等 。 1998年在德国召开的国际糖生物学讨论会上又更改 为糖生物工程（glycobiotechnology）。 （三）发达国家政府对糖生物学研究的支持： 英国：牛津大学 Raymond Dwek 教授曾在1988 年在“生化年鉴”上发表了题为 Glycobiology 的综 述，开创了“糖生物学”研究的新纪元。 1991年牛津大学创刊了 Glycobiology 专业杂志 1992年建立糖生物学研究所。 日本：1989年，创办“糖科学与糖工程动态”杂志， 同年政府提出“糖工程基础与应用研究推进战略”，并实 施“糖工程前沿计划” ，该计划包括：糖工程、糖分子生 物学和糖细胞生物学，总投资达百亿日元。 美国：1986年，政府资助佐治亚大学创建“复 合糖类研究中心”（CCRC），并建立数据库和提 出“糖库计划”。每二年召开一次“糖工程”会议，明 确提出”生物化学中最后一个重大前沿，糖生物学 的时代正在加速来临。 欧盟：1994-1998年间也提出了“欧洲糖类研究 开发网络”计划，企图在该领域的基础研究与产业 化开发上与美、日抗衡。 （四）重大突破和与现代医药学的密切关系 1、糖类作为信息分子在受精、发生、发育、分化， 神经系统和免疫系统衡态的维持等方面起重要 作用。 2、炎症和自身免疫疾病、衰老、癌细胞的异常增 殖与转换和病原体感染等生理和病理过程都有 糖类的介导。 21世纪生命科学的研究焦点是对多细胞生物的 高层次生命现象的解释，因此糖类研究必将成为生 命科学的新前沿。 二、糖基化作用（glycosylation）与糖化作用 （glycation） 糖基化作用是指单糖、寡糖或多糖链可由酶 催化与蛋白质或脂类等非糖物质的特定部位共价 结合形成糖复合物的过程。 糖化作用是由还原糖上的-CHO基与蛋白质 或核酸分子上的游离氨基间形成西夫氏碱，经过 Amadori重排后生成早期糖化产物，再经过脱水和 重排产生一些带有棕黄色荧光的晚期终末糖化产物 （advanced glycated endproducts,AGE）的过程 ，所以也称非酶糖化反应或Millard反应。 参 考 书 Ajit Vark,et al : “Essentials of Glycobiology” 陈惠黎等：“糖复合物的结构和功能” 方福德等：“分子生物学前沿技术” 糖 的 化 学 （chemistry of carbohydrate) 一、单糖分子结构特点 （一）构型 D 型和 L 型： 定位编号最高的手性碳原子的构型与甘油醛比 较，或 D 型或 L型。 CHO HC*OH CH2OH CHO HOC*H CH2OH D-(+)-甘油醛L-(-)-甘油醛 D-型和 L-型甘油醛的结构 CHO HCOH HOCH HC HO HC*OH CH2OH CHO OHCH HCHO HC HO OH C*H CH3 D-葡萄糖 D-甘油醛 L-岩藻糖糖 开 链 结 构 CHO HC*OH CH2OH O OH H H OH OHHO CH2OH H H -D-葡萄糖 O H OH OH H OH HO CH3 H H -L-岩藻糖 Haworth式结构 O CH2OH H H HO OH H H HO HO H O H OH H OH H HO H HO H -D-葡萄糖 葡 萄 糖 椅 型 结 构 H H CH3 -L-岩藻糖 H OH C* HCOH HOCH O HCOH HC* CH2OH -D-葡萄糖 -L-岩藻糖 D-型葡萄糖环状结构 H OH C* HOCH O HCOH HCOH C* CH3 -构型和 -构型： 环状结构使C1位成为手性碳，C1位的半缩醛 羟基与C5位的羟基处同侧为-构型，反之则-构型。 H OH C* HCOH HOCH O HCOH HC* CH2OH -D-葡萄糖 D-型葡萄糖环状结构 HO H C* HCOH HOCH O HCOH HC* CH2OH -D-葡萄糖 O OH H H OH OH HO CH2OH H H -D-(+)-葡萄糖 O OH H H OH OH HO H H H -D-(+)-葡萄糖 D-型葡萄糖Haworth式结构 O CH2OH H H HO OH H H HO HO H O CH2OH H H HO OH H H HO HO H -D-葡萄糖 -D-葡萄糖 葡 萄 糖 椅 型 结 构 H CH2OH O OH H H OH H HO CH2OH OH H -D -葡萄糖（Glc ） O OH OH H H OH HO CH2OH H H -D -甘露糖（Man） O OH H H OH H H CH2OH OH HO -D -半乳糖（Gal） 葡 萄 糖 的 立 体 异 构 体 （二）立体异构体 （三）衍生糖 O H OH OH H H H H OH HO CH3 L-岩藻糖（Fuc） O OH H H NH-CO-CH3 H HO CH2OH OH H N-乙酰- -D-葡萄 糖胺（GlcNAc） O OH H H NH-CO-CH3 H H CH2OH OH HO N-乙酰- -D-半乳糖 胺（GalNAc） 甲基糖类 氨 基 糖 类 HHH HH O OH H H OH H HO COOH OH HO OH H H OH H HO COOH OH H H H 葡萄糖醛酸L-艾杜糖醛酸 糖 醛 酸 类 CHOH | CHOH | CH2OH O H COOH OH OHH HHH H3C-CO-NH HO-H3C-CO-NH CHOH | CHOH | CH2OH O H COOH OH OHH HHH N-乙酰-神经氨酸（NeuAc）N-羟乙酰-神经氨酸（NeuGc） 唾 液 酸 类 二、单糖间的连接 糖苷键 糖复合物的糖链，在其糖苷键的连接中，必 有一个是半缩醛羟基，另一个醇羟基。按照半缩 醛羟基是- 或 -，糖苷键可分为 -糖苷键或 - 糖苷键，再标明其连接部位。 如： O OH H H NH-CO-CH3 H CH2OH OH H N-乙酰- -D-葡萄 糖胺（GlcNAc） H O OH H H H CH2 H -D-甘露糖（Man） H 14 23 5 6 14 23 6 5 O O OH OH H H H HO CH2OH H H 14 23 6 5 -D-甘露糖（Man） O 还原端 非还原端 -1,4 糖苷键 -1,3 糖苷键 OH O OH OH H H H HO CH2OH H H 14 23 6 5 O -1,6 糖苷键 -D-甘露糖（Man） 糖链结构的复杂性： 核酸和蛋白质可以储存大量的生物信息，是以分 子量大为基础，而糖类作为信息分子则是以其结构多 样性为特征。 单糖和氨基酸（核苷酸）形成异构体数目的比较 单体种类和数目 肽（多核苷酸） 糖类异构体数目 类异构体数目 XX XY XXX XYZ 11 36 176 1056 1 2 1 6 三、自然界中糖类存在形式 游离糖：单糖（及其衍生物）、寡糖、聚（多）糖 结合糖（糖复合物或糖结合物）指糖类与蛋白质 （多肽）或脂类共价结合的复合物，如：糖蛋 白、蛋白聚糖、糖脂和脂多糖 近年来，发现的一类新的糖复合物，即由糖类、脂 类和蛋白质三者组成，被称为糖基化磷脂酰肌醇蛋白 （glycosyl-phosphatidyl inositol protein）， 简称GPI蛋 白。这类结合蛋白通过GPI的脂肪酸插入膜脂双层的外 层，被锚固在膜上。 NH CH2 CH2 O -O-P=O O 6 2Man12Man16 Man14GlcNH21O O -O-P=O O CH2 CH2 NH2 HO OH OH OH O -O-P=O O CH2-CH-CH2 R2 R1 O O-C-(CH2)14-CH3 R4 R3 NH2-蛋白质-C=O +/-额外的 磷酸乙醇胺 +/-额外的 棕榈酰基 磷酸乙醇胺桥 GPIGPI蛋白模式示意图蛋白模式示意图 6 R1和 R2 :饱和脂酸（少 数不饱和） R3和 R4:糖基或糖链 PP GlcNAc P GlcNH2 GlcNAc-UDP UDP Ac P GlcNH2 -(Man）3 Dol-P-Man X 3 Dol-P P Man-( Man）2 -GlcNH2 P EtN HO P EtN P R OH 内质网 P R GPI 的生物合成 N N C P Man-( Man）2 -GlcNH2 P EtN P Man-( Man）2 -GlcNH2 P EtN N 内质网内质网 腔面 细胞质 有 关 合 成 酶 系 蛋白质的蛋白质的GPIGPI化化 GPI蛋白质的分类： 1、细胞表面的水解酶：碱性磷酸酯酶、乙酰胆碱酯酶、二肽酶 2、原虫外表的抗原蛋白：锥虫可变表面蛋白、疟原虫裂殖体表 面蛋白抗原 3、淋巴样抗原：脊椎动物脑和啮齿类动物胸腺细胞的Thy-1 抗原 4、粘着分子：神经原的NCAM-120、大鼠肝硫酸类肝素蛋白聚糖 5、GPI化的小肽：小细胞肺癌的细胞表面一种抗原，可作为CD -24信号转导分子 6、GPI相连的蛋白聚糖：glypican MW=6.2万 558个氨基酸残 基 含4条HS（硫酸肝素）糖链（3条在C端，1条在N端） 7、其他：衰变加速因子（decay accelerating factor，DAF ）、 人癌胚抗原（CEA） GPI 结合蛋白的主要生理功能 一、与免疫及神经细胞活化 二、与信息传递的关系 三、与受体 糖 蛋 白 （glycoprotein） 一、糖蛋白糖链结构的特征 （一）糖链与肽链的连接方式及其分型 O O NH N-C-CH2-CH C=O NH C=O CH3 CH2OH O NH O-CH2-CH C=O NH C=O CH3 CH2OH Ser/Thr残基 Asn残基-GlcNAc-GalNAc 图3-1 N-糖苷键和O-糖苷键连接方式 OHOH N-连接（寡）糖链（简称N-糖链） O-连接（寡）糖链（简称O-糖链） 罕见的糖链与肽链的连接方式 连 接 方 式 举 例 N-乙酰氨基葡萄糖 丝氨酸/苏氨酸 细胞质和核中糖蛋白 半乳糖基 羟脯氨酸 阿拉伯半乳聚糖蛋白、藻类 细胞壁糖蛋白 半乳糖基 丝氨酸 马铃薯凝集素、藻类细胞壁 糖蛋白、地蚕表皮胶原 甘露糖基 丝氨酸/苏氨酸 酵母聚甘露糖真菌糖肽、 Clamworm表皮胶原 L-岩藻糖 苏氨酸 人尿糖肽、大鼠糖蛋白 半乳糖 半胱氨酸（S-糖苷键） 人尿糖肽 葡萄糖 半胱氨酸（S-糖苷键） 鳕变态反应原 M、红细胞 膜糖肽 （二）N-连接糖链和O-连接糖链 1、 N-连接糖链的结构特点 Man Man Man Man Man Man Man Man Man GlcNAc GlcNAc Asn N-N-连接寡糖的分型连接寡糖的分型 高甘露糖型 SA SA Gal Gal GlcNAc GlcNAc Man Man Man GlcNAc GlcNAc Asn Fuc GlcNAc 杂交型复合型 Gal GlcNAc Man Man Man GlcNAc GlcNAc Asn GlcNAc Man Man 1,4 1,4 1,3 1,6 1,4 1,4 1,4 1,4 1,3 1,6 1,6 1,3 1,4 1,4 1,6 N-N-连接糖链的核心五糖区结构连接糖链的核心五糖区结构 SA Gal SA SA GlcNAc Gal Gal Man GlcNAc GlcNAc Man GlcNAc GlcNAc Asn SA Gal GlcNAc Man Man GlcNAc Asn Gal GlcNAc 几种特殊的N-连接糖连结构 A：大鼠肝细胞膜糖蛋白的糖肽 B：人红细胞膜唾液酸糖蛋白的糖肽 带有血型物质的复杂型带有血型物质的复杂型N-N-连接糖链连接糖链 2、 O-连接糖链的结构特点 （1）O-GalNAc糖链 （2）O-GlcNAc糖链 Gal1 3GalNAc - - Ser/Thr Gal1 GlcNAc1 GlcNAc1 3GalNAc - - Ser/Thr GlcNAc1 GlcNAc1 GlcNAc 1 3GalNAc - - Ser/Thr GlcNAc 1 3GalNAc - - Ser/Thr GalNAc - - Ser/Thr 3 6 GalNAc - - Ser/Thr 3 6 常见常见O-O-GalNAcGalNAc糖链的核心结构糖链的核心结构 O-O-GlcNAcGlcNAc糖链特点糖链特点 1、仅存在于细胞质和细胞核中 2、糖基化位点只连接有1个GlcNAc糖基 3、糖基化处动态平衡 O CH2OH H H AcNH O H H HO HO H -D-葡萄糖 O CH2OH H H AcNH O H H HO HO H -D-葡萄糖 TyrSerProThrSerProSer O-GlcNAc Transferase O-GlcNAcase O-GlcNAc 结构图解 ProtenProten GlcNAc UDP3HGal + ProtenProten GlcNAc 3HGal UDP + Galactosyltransferase NEUCLEAR PROTEINS Nuclear pore proteins RNA polymerase II Many transcription factors C-Myc oncoprotein v-Erb-a oncoprotein P53 tumor suppressor SV40 T antigen Tyrosine phosphatase Many chromatin proteins Estrogen receptors Fungal DNA-binding proteins 已确定的 GlcNAc 糖基化蛋白质 （） CYTOSKETETAL PROTEINS Cytokeratins 13，8，18 neurofilaments H，M，L human erythrocyte Band 4.1 Synapsin I many synaptic vesicle proteins MAPs tau Talin vinculin Clathrin assembly protein AP3 Apasia 已确定的 GlcNAc 糖基化蛋白质 （） OTHER PROTEINS 92-KD Ser protein P43/hnRNP adenovirus fiber human CMV UL32 rotavirus N526 protein baculovirus gp41 tegument protein p67 translation redulation protein malarial proteins trypanosome proteins giardia proteins E.Histolytica proteins schitosome proteins 已确定的 GlcNAc 糖基化蛋白质 （3） （三）糖基化位点 N-糖链的糖基化位点 特异的氨基酸序列（也称序列子）： Asn X - Ser/Thr X 可以是 Pro 以外的任何氨基酸。序 列中X位氨基酸的性质可能与合成的糖链结 构有关。 极性氨基酸 复杂型糖链 非极性氨基酸 高甘露糖型糖链 糖基化位点和糖基化位点和 肽链氨基酸序列肽链氨基酸序列 O CH2OH NH C=O CH3 OH -GlcNAc H2C O CH-R2 C NH C CH HN C CH NH C O R1 O O H C N H OH Asn 除Pro外任 何氨基酸 Ser/Thr OH S/L-S*-T*-T*-E/G-V-A-M-H-T*-T*-T*-S*-S-S-V-S*-K-S*- O - GalNAc 糖链的糖基化位点 人红细胞膜上血型糖蛋白A的N-端序列 与糖基化位点 特点：1、分子表面 2、Ser/Thr比较集中的序列 常见四类O-GalNAc糖基化位点序列结构 1、-T-X-X-X-， 其中有1个X为Thr 2、-X-P-X-X-X-，其中有1个X为Thr 3、-X-X-T-X-，其中有1个X为碱性氨基酸残基 4、-S-X-X-X-，其中有1个X为Ser （四）糖链的微观不均一性（糖型） 糖蛋白 分型 A 型 非糖蛋白 B 型高甘露糖型 C 型复杂型 D 型复杂型 注：BP-RNase 的34位上N-糖链结构差异 牛胰核糖核酸酶（牛胰核糖核酸酶（BP-BP-RNaseRNase） IgG的Fc段Asn297上可能有30余种糖链结构 注：S 唾液酸 G 半乳糖 N N-乙酰氨基葡萄糖 M 甘露糖 F 岩藻糖 S-G-N-M F N-M-N-N-Asn S-G-N-M S-G-N-M F N-M-N-N-Asn G-N-M G-N-M F N-M-N-N-Asn G-N-M S-G-N-M F M-N-N-Asn S-G-N-M S-G-N-M F M-N-N-Asn G-N-M G-N-M F M-N-N-Asn G-N-M G-N-M F M-N-N-Asn N-M M F M-N-N-Asn N-M N-1 N-2 N-10 N-15 IgGIgG糖链多种可能的结构糖链多种可能的结构 二、糖链的生物合成 （一）基本特点（供体、受体和糖基转移酶） 1、糖基供体 核苷酸形式 如：UDP（ Glc、GlcNAc、Gal、GalNAc、 Xyl、Ara、GlcUA 和 IduUA ） GDP（ Man 和 Fuc ） CMP（ NeuAc ） 磷酸长（多）萜醇（ dolichol，Dol ） 如：Dol-P-P（ Man、Glc 和 GlcNAc ） 磷酸长（多）萜醇的合成过程： 乙酸HMGCoA异戊烯焦磷酸 法尼基焦磷酸 多萜醇磷酸多萜醇 CH3 CH3 CH3 CH3-C=CH-CH2-CH2-C=CH-CH2n-CH2-CH-CH2-CH2-O-P-O-糖基 （n=15-19） 磷酸长萜醇结构式 2、受体 糖基第一受体通常是肽链中特定氨基酸残基。 糖链延长时，新接上糖基的几个羟基都可以是下一糖 基的接受体，可形成分支。 3、糖基转移酶 N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶（GlcNAc T） 种类 功能特点 糖基供体 1 I 2 II 3 III 4 IV 5 V 6 VI 7 8 五糖核心区的GlcNAc的转移 五糖核心区内不同 Man或 同一Man上不同位置的GlcNAc 的转移 外围链Gal上GlcNAc的转移， 进而形成重复的(Gal-GlcNAc)n的 结构 Dol-P-P-GlcNAc UDP-GlcNAc Man 14 GlcNAc - 6 4 3 GlcNAc T-I GlcNAc 1 GlcNAc T-II GlcNAc 1 GlcNAc T-III GlcNAc 1 GlcNAc T-IV GlcNAc 1 GlcNAc T-V GlcNAc 1 GlcNAc T-VI GlcNAc 1 Man 1 Man 1 6 4 2 4 2 五糖核心区 （二）N-糖链的生物合成 （内质网和高尔基体，两个阶段，为伴翻译） 第一阶段：G-寡糖-脂质中间体的合成和转移 （内质网） 第二阶段：糖链的后加工和各型N-糖链的成熟 （内质网和高尔基体） Glc Glc Glc Mane Mang Mani Mand Manf Manh Manb Manc Mana GlcNAc GlcNAc - P-P-Dol G- G- 寡寡 糖糖 的的 结结 构构 ( Glc )3 ( Man )9 ( GlcNAc )2 -P-P-Dol 1, 2 1, 3 1, 3 1, 2 1, 2 1, 2 1, 2 1, 3 1, 6 1, 6 1, 3 1, 4 1, 4 G- G- 寡寡 糖糖 - -脂脂 质质 体体 合合 成成 示示 意意 图图 GDP-Man + P-Dol Man-P-Dol + GDP UDP-Glc + P-Dol Glc-P-Dol + UDP 反应（1） 反应（2） G-寡糖合成的基本特点： 1、第一个Man是-异头体连接，其余Man均为-异头 体连接，方式可以是 13，或 16 和 12 。 2、前5个 Man 供体都是GDP-Man，后4个 Man 供体 为Dol-P-Man，反应在内质网膜的两侧进行。 3、末端3个Glc 有两种连接方式，即13或12 。 4、衣霉素（tunicamycin）可以抑制 G-寡糖的合成。 衣衣 霉霉 素素 的的 结结 构构 N-乙酰葡萄糖胺 尿苷 (Glc)3(Man)9(GlcNAc)2 (Glc)3(Man)9(GlcNAc)2 Asn P-P-Dol 寡糖转移酶 - - - Asn - - - P-P-Dol G-G-寡糖的转移和蛋白质的寡糖的转移和蛋白质的N-N-糖基化糖基化 1、高甘露糖型糖链的成熟 （1）切除3个Glc后，剩余部分Man即可，如：大豆凝集素 （2）根据需要切除部分Man （次序是g、e、i、d 和 f、h ）， 在通过Man T连接必要的Man形成各种高甘露糖型糖链。 Mane Mang Mani Mand Manf Manh Manb Manc Mana GlcNAc GlcNAc - P-P-Dol 1, 2 1, 2 1, 2 1, 2 1, 3 1, 6 1, 6 1, 3 1, 4 1, 4 Glc Glc Glc 水解 2、杂合型糖链的成熟 切除 g、e、i、d 后，在 b 位接上 ( GlcNAc - Gal )n 和 NeuAc，并可形成分支。 Manf Manh Manb Manc Mana GlcNAc GlcNAc - P-P-Dol 1, 3 1, 6 1, 6 1, 3 1, 4 1, 4 ( Glc )3 Mane 、Mang 、 Mani 和 Mand NeuAc Gal GlcNAc n 水解 水解 3、复杂型糖链的成熟 切除 g、e、i、d 位Man，在 b 位Man上连接 ( GlcNAc - Gal )n 和 NeuAc后，可形成分支。再进一步切除 f 和 h 位Man，并 连接( GlcNAc - Gal )n 和 NeuAc，也可形成分支。 Manb Manc Mana GlcNAc GlcNAc - P-P-Dol 1, 6 1, 3 1, 4 1, 4 ( Glc )3 Mane 、Mang 、 Mani 和 Mand 水解 水解 Manf 、 Manh 水解 NeuAc（Fuc ） Gal GlcNAc n NeuAc（Fuc ） Gal GlcNAc n 高甘露糖型糖链的成熟杂合型和复杂型糖链的成熟 糖链合成的终止信号 一般认为外围链的-Fuc 或-NeuAc （三）O-糖链的生物合成 （主要在高尔基体，芽生式合成，为翻译后加工） （四）溶酶体酶的糖基化 （Man-6-P识别信号） Mane Mang Mani Mand Manf Manh Manb Manc Mana GlcNAc GlcNAc - -Asn- - 1, 2 1, 2 1, 2 1, 2 1, 3 1, 6 1, 6 1, 3 1, 4 1, 4 水解 ( Glc )3 Mane Mani Mand Manf Manh Manb Manc Mana GlcNAc GlcNAc 1, 2 1, 2 1, 2 1, 3 1, 6 1, 6 1, 3 1, 4 1, 4 -PP- - -Asn- - Mang 甘露糖苷水解酶 （ER） Man-6-P生成反应： Man Man6-P-GlcNAcMan-6-P GlcNAc磷酸转移酶 UDP-GlcNAc UMPH2O GlcNAc 三、糖链的降解和代谢病 降解场所:溶酶体内 降解方式： （一）N-糖链的降解 含N-糖链的肽链 一定长度含N-糖链的肽片段（糖肽） 切除五糖核心区的Fuc N-糖链-GlcNAcGlcNAc-Asn 各种单糖基及其衍生物 GlcNAc + 肽片段 各种氨基酸 + 蛋白水解酶 部分蛋白肽链降解在先 岩藻糖苷酶 GlcNAc酶 F 各种外切糖苷酶 肽-N-聚糖水解酶 F （ PNG酶 F ， peptide-N-glycanase F ) 专一性水解酶 （二）O-糖链的降解 视糖链的多寡而言。一般糖链不多者，糖 链和肽链降解同时进行；糖链较高者，则糖链 降解进行在前，尤其是NeuAc，肽链降解在后 。 （三）糖链增多症 也称溶酶体贮积性疾病（ lysosomal storage diseases ），大多数为常染色体隐性遗传病。其原因可能是： 酶蛋白合成的缺陷 酶蛋白不能糖基化或磷酸化，不能定向投送到溶酶体 投送到溶酶体过程中，出现异常，如Man-6-P受体结 合能力变弱 与二天线与二天线N-N-糖链降解有关的糖链增多症糖链降解有关的糖链增多症 及其相关酶的缺陷及其相关酶的缺陷 四、糖蛋白糖链的生物学功能 （一）常用的研究策略 （）比较不同糖链的同种糖蛋白的生物学活性 。 （）应用内切和外切糖苷酶观察糖链或糖链中 某些糖基的生物学功能。 （）应用糖链合成或加工抑制剂，可在细胞水 平研究整条糖链的生物学功能，或研究不 同糖链类型对糖蛋白代谢和功能。 主要抑制剂： 衣霉素（tunicamycin） 抑制整条糖链的合成 castanospermine ( CS ) deoxynojirimycin ( DNM ) deoxymannojirimycin ( DMM ) e swainsonie ( SW ) 抑制-葡萄糖苷酶和 II 抑制-甘露糖苷酶和 II （）应用基因DNA定点突变技术，研究整条糖 链功能： 为维持蛋白质构象不改变，糖基化位点氨基 酸拟以相同性质氨基酸取代较妥。 （）应用糖基转移酶的基因工程技术，可以观 察糖链加工的某过程发生障碍和某一糖基 缺失，或过度表达时对糖链生物学功能的 影响。 常用基因剔除（knockout）、反义核酸封闭 或转基因技术。 （）利用糖基化过程不同步骤异常的细胞突变 株，根据细胞行为的改变来研究不同结构 糖链的功能。 例如：中国仓鼠卵巢细胞（CHO）的Lec1和 株，分别缺失 GlcNAc T II 和 V ，Lec 29 和 30 则可过度表达1，3 Fuc T。 例如：幼仓鼠肾细胞（BHK）的RicR15和19 株，是缺失-甘露糖苷酶 II的细胞株。 （二）寡糖链的主要功能 1、在维持糖蛋白分子构象及其细胞内转运中的作 用 （1） 影响新生肽链正确折叠和亚基聚合 举例（1）： G-寡糖链中3个Glc基对肽链折叠至关重要。 (Man)9(GlcNAc)2-Asn UDP-Glc：糖蛋白 葡萄糖基转移酶 UDP-Glc UDP Glc-(Man)9(GlcNAc)2-Asn （单葡萄糖十二糖基 糖链） 内质网上钙连蛋白（calnexin）为凝集素样蛋白，具分子 伴侣作用可以识别上述单葡萄糖十二糖基糖链，并与之结合， 引导肽链正确折叠。然后，钙连蛋白脱离糖蛋白，同时Glc又 被葡萄糖苷酶水解去除，糖链继续加工成熟。 举例（2）： 运铁蛋白（ transferrin, Tf ）受体蛋白肽链的Asn-251、 317和727分别为3条N-糖链，但是其功能各不相同。Asn-251为 三天线复杂型，它的缺失使Tf受体不能形成二聚体，从而影响 受体的投递和功能。Asn-727是高甘露糖型，带磷酸基，在肽 链折叠和运送中起重要作用。 举例（3）： 纤连蛋白（ fibrinectin, Tn )受体正常功能形式为二聚体 （如51），经天冬酰胺酶F（即PNG酶F）或GlcNAc酶F处 理，即不能形成二聚体，从而丧失功能。 Manb Manc Mana GlcNAc GlcNAc Asn 天冬酰胺酶 F GlcNAc酶 F 其可能的原因： a 糖链是维持亚基正确构象所必需的，亚基的正确构象 又是其聚合的基础。 B 亚基上存在糖链结合区，可以识别和结合另一亚基的 糖链。 C 亚基间糖链和糖链的相互作用。 Asn297 Asn297CH2 CH2 CH3CH3 a bc g g c c IgG中Fc段Asn297上两条N-糖链的相互作用 细线为肽链，粗线为糖链，CH2：Fc段中恒区重链第2结构域，a、b、c 为糖链的外围链，g为核心五糖部分 （2）在细胞内转运和防止其降解中的作用 举例（1）： 7721肝癌细胞经衣霉素处理后，细胞表面Tf受体明显减， 少，但是受体合成并不受阻。这说明Tf受体蛋白的分拣和投送 过程受到影响。 举例（2）： 衣霉素不能改变CHO细胞表面血型糖蛋白含量，但是可以 使缺失O-GalNAc糖基化的CHO细胞突变株表面glycophorin含量 明显减少，说明不仅N-糖链可以影响糖蛋白在细胞内转运，而 且O-糖链也可以起到同样的作用。 抑制糖基化对糖蛋白在细胞内分泌的影响 糖蛋白 细胞分泌 IgG IgM IgA 28%抑制 85%抑制 64%抑制 举例（3）： 糖修饰对糖蛋白的稳定性的影响 糖蛋白 含糖量 处 理 保留糖量 稳定性 （%） （%） 葡萄糖氧化酶 酵母表面核酸酶 鼠干扰素 葡萄糖淀粉酶 I 12 50 高碘酸氧化 内切-GlcNAc苷酶 衣霉素 高碘酸氧化 4.8 5 * * 仅存在变性剂的情况下 2、免疫屏障作用 免疫屏障作用是指阻止肽链中一些抗原决定簇被 免疫系统识别而产生抗体的功能。 例如： 使用E.Coli表达的无糖链的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因 子（GM-CSF）可使部分患者产生抗体。 原因是其相应的抗原决定簇恰好位于肽链中原O- GalNAc糖基化位点。糖基化使该抗原决定簇被掩盖。 此外，免疫屏蔽作用还表现糖链末端糖基可以阻断糖链 其余部分产生抗体。 例如： IgG的N-糖链末端缺乏Gal时，即暴露GlcNAc可产生自身 抗体，与类风湿性关节炎等自身免疫性疾病有关。 3、寡糖链与蛋白质活性关系密切 部分酶为糖蛋白，糖链不仅在酶蛋白构象形成、转运 和防止水解等方面起十分重要的作用，而且部分酶催化活 性必须依赖其糖链。 例如： （1）在原核细胞中表达的溶酶体-葡萄糖苷酶，只能 表现免疫原性，但完全没有酶的催化活性。 （2）HMG-CoA还原酶在去糖基化后，其催化活性可 降低90%以上。 （3）脂蛋白脂酶的N-寡糖链的五糖核心是其催化活性 所必需，而其外围链部分则对催化活性作用不大。 其原因可能是糖链改变了酶分子的疏水性、电荷性质 、 溶解度和粘性等，通过影响酶蛋白分子的构象及其稳定性 来改变酶的活力。 此外，某些蛋白质或激素的生物学活性也与其糖链结 构关系密切， 例如： 人促红细胞生成素（human erythropoietin，EPO）是 一种糖蛋白，由165个氨基酸残基组成，其肽链第 24、38和 83位连接有N-糖链，第126位是O-糖链。研究表明当其基因 在原核细胞中表达，所得的产物没有生物学活性；而在哺乳 动物细胞或昆虫细胞中表达的产物就有活性，但也有明显差 异。 原因是各种表达细胞中翻译过程或翻译后的糖基化加工 修饰不同。据研究发现其分子肽链中N-糖链是活性所必需， 第38位上的N寡糖链与分泌关系密切。 4、在细胞识别中的作用 （1）在细胞受体-配体结合中的作用 a、糖基介导的细胞吞噬作用 例如： 血浆铜蓝蛋白（每分子约含10个NeuAc）。当除去其中 2个NeuAc，血浆铜蓝蛋白的半衰期从45分钟降至3-5分钟。 当采用NeuAc基转移酶有重新接上末端NeuAc，其半衰期可 得到恢复。 当用 -半乳糖苷酶或半乳糖氧化酶去除或破坏其暴露的 末端Gal（吞噬细胞识别的标志），有可使其半衰期得到延 长。 去唾液酸铜蓝蛋白 64Cu铜蓝蛋白 表记的去唾液酸表记的去唾液酸 血清糖蛋白在大鼠血浆中血清糖蛋白在大鼠血浆中 的存留时间的存留时间 注射的标记物/ml血浆（%） 时间（分） （摘自Morell,A.G.,et al, 1971, J.Biol.Chem. HH 3 3 血清中的放射性（%） 注射后时间（分） 64Cu标记的天然的和修饰的家兔血清铜蓝蛋白从血循环消失的速度 1 3 5 2 1、铜蓝蛋白 2、去唾液酸铜蓝蛋白 3、氧化的去唾液酸铜 蓝蛋白 4a、3H双标记去唾液 酸铜蓝蛋白 4b、64Cu双标记去唾 液酸铜蓝蛋白 5、去唾液酸、去半乳 糖铜蓝蛋白 （摘自Morell,A.G.,et al, 1968, J.Biol.Chem.,243,155） 4a 4b （2）在激素-受体结合中的作用 例如： a、HCG 大鼠卵巢的HCG受体蛋白肽链上有6个N-糖基化位点，当 采用定点突变方法，将其中Asn173Gln后，HCG与其受体的 结合能力将完全丧失； 当将Asn77Gln和Asn152Gln后，可使其与受体的亲和 力下降80%； 如定点突变发生在Asn269、Asn277和Asn291，则其结合 能力不受影响。 b、EPO 正如前述，EPO分子的糖链结构不同表现其生物学 活性有明显差异，其原因除糖链与维持分子构象有关外， 主要还是分子中N-糖链参与其与受体分子之间识别和相互 结合过程。 据报道含二天线N-糖链的EPO较四天线对配体的亲和 力高3倍左右；仅剩五糖核心区N-糖链EPO约为完整N-糖 链的5倍。 （3）在非激素受体-配体结合中的作用 例如： 运铁蛋白（transferrin， Tf）受体对Tf糖链的识别 正常人血清中Tf的N-糖链主要为二天线，并不带核心 Fuc，其与受体结合的Kd=4.9 x 10-8mol/L；而孕妇血清中较 多为三或四天线，并带核心Fuc，其Kd= 9.8 x 10-8mol/L；两 者相较，亲和力后者低约50%。 （4）在病原体侵袭中的作用 流感病毒：病毒通过识别黏膜细胞表面糖链末端的唾液 酸入侵，但是不同的型的病毒专一识别不同的类型的唾液酸。 A型 B型 5-乙酰神经氨酸 或 5-羟乙酰神经氨酸 （Neu5Ac） （Neu5Gc） C型5，9-二乙酰神经氨酸（Neu5，9Ac2） 流感病毒 细菌：肺炎双球菌识别肺和脑膜细胞表面糖链末端的 GlcNAc；而嗜腐球菌主要识别泌尿道细胞表面糖链末端的 GalNAc和 GlcNAc。 寄生虫：恶性虐原虫裂殖子通过识别红细胞表面血型糖蛋 白A（ glycophorin A）糖链末端的NeuAc，而入侵红细胞。 （5）在精-卵细胞识别中的作用 在受精过程中，首先由精子和卵细胞膜外称透明带的糖 蛋白层结合，诱发精子的顶体反应。只有经过顶体反应的精 子才能穿过透明带与卵细胞膜融合，完成受精过程。 透明带糖蛋白层含3种蛋白，分别为ZP-1、ZP-2和ZP-3 ，前两者都带有N-糖链，但只有ZP-3含O-GalNAc糖链。精子 通过其精子蛋白（SP56，分子量为5.6万）识别ZP-3分子上O- GalNAc糖链，很可能是糖链上的-Gal，而与之结合诱发顶 体反应。实验证明用半乳糖氧化酶处理ZP-3后，可阻止其与 精子的结合。 精子 SP56 ZP3半乳糖 精-卵细胞相互识别示意图 透明带 成熟卵细胞 卵细胞膜 Figure 20-26. Schematic drawing of how the cortical reaction in a mouse egg is thought to prevent additional sperm from entering the egg. The released contents of the cortical granules both remove carbohydrate from ZP3 so it no longer can bind to the sperm plasma membrane and partly cleave ZP2, hardening the zona pellucida. Together these changes provide a block to polyspermy 5、 在细胞粘附中的作用 参与细胞粘附的分子绝大多数是N-糖链的糖蛋 白，如：整合蛋白（integrin）、选择素（selectin） 、免疫球蛋白家族和纤连蛋白（fibrinectin，Fn） 等。 整合蛋白（51）是高度N-糖基化的糖蛋白，亦 为Fn的受体。近期发现Fn的糖链不影响其与整合蛋白 的结合；但是，整合蛋白糖链的变化却可明显影响其 与Fn的结合反应。如： 糖苷酶处理51后，当去除末端 NeuAc、Gal 和 GlcNAc残基，主要是 GlcNAc，其粘附活性可下降 60%。 原因是5和1亚基上N-糖链可促进亚基的聚合和 维持特定的构象，这是两者有效结合的基础。 五、糖链结构与疾病 （一）细胞癌变与糖链结构的改变 细胞癌变后，除常发现细胞表面Fn丢失和一 些新的糖蛋白合成之外，主要表现是细胞表面糖蛋 白糖链结构的变化。 1、恶性肿瘤细胞糖蛋白N-糖链结构改变的主要 类型 恶性肿瘤细胞膜上糖蛋白N-糖链结构改变类型 类 型 酶 学 机 制 天线数增加(1) LacNAc重复序列出现或增加(2) 核心Fuc增加 出现偏二天线N-糖链(3) 平分型（bis-）GlcNAc增加 外围链Fuc增多 末端NeuAc连接键改变(4) 高Man型N-寡糖链出现和增加 末端NeuAc数量变化 GlcNAc T（IV和V）活力增高 13GlcNAc T活性增高 16Fuc T 活力增