分子生物学技术和食源性致病菌的快速检测.ppt

分子生物学技术和食源性 致病菌的快速检测 1. 与细菌有关的一些分子生物学和 细胞生物学技术; 2. PCR技术; 3. 荧光PCR技术; 4. 相关的一些分子生物学技术在食源性致病菌 的快速检测技术中的应用; 5. 一实例分析个案 与细菌有关的一些分子生物学和 细胞生物学技术 核酸的抽提与纯化(DNA, RNA, 质粒DNA等) 相关核酸的鉴定(PCR, 限制性内切酶和酶切技术及 产物分析, 重组技术, 探针, Southern blotting, Northern blotting, 芯片技术, 序列分析等) 蛋白质的提取与纯化 相关蛋白质的鉴定(Western blotting, 抗原抗体复合物, 标记技术,芯片技术, 序列分析等) 培养细胞技术(用于细菌毒素测定的MTT方法) 核酸的抽提与纯化 DNA-微量法(平衡酚, 氯仿,乙醇);大量法(碱 列解); 离心法 RNA 质粒DNA -碱变性法, Kit-Qiagen公司 PCR产物- Kit 细菌-直接裂解:释放出DNA PCR-聚合酶链式反应 （Polymerase Chain Reaction, PCR） 在体外通过酶促反应进行一段特定DNA或RNA片段扩增的 技术为获取目的为获取目的DNADNA片段的一项常规技术片段的一项常规技术( (诊断和检测 诊断和检测) ) 原理原理: : PCR一般过程： 1.变性（denaturation） ： 加热使DNA双螺旋的氢 键断裂,双链解离形成单 链DNA。 2.退火（annealling）： 温度降低时使引物和其 互补的模板在局部形成 杂交链。 3.延伸（extension）： 在DNA聚合酶和4种脱 氧核糖核苷酸及Mg2存在 的条件下，催化DNA链延 伸反应。 模板DNA 或RNA 一对寡核苷酸引物 4种脱氧核糖核苷酸(dNTPs) 热稳定的聚合酶(Taq)； Mg+缓冲液。 PCR-聚合酶链式反应体系 凝胶电泳：经溴化乙锭染色，在紫外照射下可见橙 红色的特异DNA扩增带并可以在图象成像仪下成像。 PCR-聚合酶链式反应产物的检测 M 1 2 3 4 5 6 7 8 N P PCR-聚合酶链式反应技术的发展 不对称PCR 反向PCR 多重PCR 差别PCR 荧光PCR 锚式PCR 重组PCR PCR固相分析 免疫PCR 反转录PCR(RT-PCR) 原位PCR 荧光PCR技术(Real Time PCR) n n 荧光是响应于一个短波光的激发，荧光是响应于一个短波光的激发， 一个长波长光被发射出来一个长波长光被发射出来 n n 每个荧光分子都有一个最有效的激发波长每个荧光分子都有一个最有效的激发波长 - -被激发的荧光分子越多，发射的荧光越强被激发的荧光分子越多，发射的荧光越强 荧光PCR技术(Real Time PCR) PCR + 荧光标记 + 监测系统 uNon-specific DNA binding dyes FSYBR Green I FEthidium Bromide uSpecific Hybridization Probes FTaqManTM Fmolecular beacons Fdual-oligo FRET pairs 荧光PCR技术(Real Time PCR) R 5 3 3 5 RRRR SYBR Green I 是一种结合于小沟中的双链DNA染料, 与双链DNA结合后, 其荧光大大增强. R R R 497nm 520nm 荧光PCR技术(Real Time PCR) TaqManTaqMan: : n n 杂交探针的互补区在引物间杂交探针的互补区在引物间 n n 55端连有一个荧光端连有一个荧光reporterreporter, , 通常是荧光素通常是荧光素 n n 33端连有一个端连有一个Quencher,Quencher,通常是通常是TAMRATAMRA n n 荧光素被荧光素被488 488 nmnm光激发，发射光为光激发，发射光为520 nm520 nm n n 520 nm 520 nm 光能激发光能激发TAMRATAMRA，发射光为发射光为570 570 nmnm R Q 5 3 3 5 R=Reporter Q=Quencher probe 荧光PCR技术(Real Time PCR) 分子分子 Beacons:Beacons: n n 探针有核心的杂交区探针有核心的杂交区 n n 探针有自互补末端探针有自互补末端 n n 在未杂交时探针呈发夹状在未杂交时探针呈发夹状 n n 报道子报道子, , 荧光素在探针的荧光素在探针的 5 5 端端 n n 猝灭子在探针的猝灭子在探针的3 3 端端 FRET Probes 53 53 l 3 DR 5 Detection Extension Step 53 1. Strand Displacement System Silent 2. Polymerization Complete System Silent 53 35 Taq 3 D R 1-5 bases D R Taq 5 R 5 荧光PCR技术(Real Time PCR) 阈值线 CT值 阈值线: 荧光阈值的缺省的设置是3-15个循环的荧光信号的标准差的10倍. CT值: 各反应管内的信号到达设定的阈值所经历的循环数. 荧光PCR技术(Real Time PCR) 阈值线 CT值 多重荧光PCR技术 FAM VIC HEX TET Cy3 Texas Red ROX Cy5 LC640 Cy5.5 LC705 490nm 660nm R 限制性内切酶和酶切技术及重组 限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异 核苷酸序列的DNA水解酶. 例如: EcoRI 可以识别 5.G AATTC.3 3.CTTAA G.5 粘性末端 T4连接酶: 重组 酶切与多态性分析技术, GFP-MIP重组结构 MIP mip基因是军团菌的巨嗜细胞感染增强子基因，具高度保守性和嗜肺军团菌种的特异性。表达的产物 mip蛋白是迄今所公认的嗜肺军团菌毒力因子之一，是嗜肺军团菌所特有，因此用来鉴定军团菌具有 很强的特异性。 GFP-MIP重组结构 Southern blotting和Northern blotting技术 R6 GFP-ras -Gp +Gp -Gp +Gp -Gp +Gp -Gp +Gp 4 10 4 10 days raf (2.5 kb) Actin 28S 18S 主要步骤: DNA(RNA)提取 和纯化; 凝胶电泳; 印迹转移; 探针和杂交 显色 芯片技术 主要步骤: 芯片的制备 DNA(RNA)提取 和纯化; 探针的制备 杂交 显色 结果判读 芯片技术 -Gp +Gp 芯片技术 T I II III IV C C 登革热病毒检测芯片: 1. 通用探针的设计, 合成和筛选, 修饰 2. 分型探针的设计, 合成和筛选, 修饰 3. 预试验, 样品的处理; 4. 杂交及洗涤, 条件优化等 5. 数据库的建立 6. 应用评价 7. 与多重PCR技术的比较 DNA序列分析 双脱氧测序(Sanger法) 化学测序(Maxam-Gilbert法) 同位素标记测序 市售商品或公司运作 DNA序列分析 Start-ATTAGACGTCCG A” T G C A ATTAG ATTA ATTAGACG ATTAGA ATTAGACGTCCG AT ATTAGAC ATT ATTAGACGTC ATTAGACGT ATTAGACGTCG A T G C - ATTAGACGTCCG - ATTAGACGTC - ATTAGACGT - ATTAGACG - ATTAGAC - ATTAGA - ATTAG - ATTA - ATT - AT - A 测序凝胶 DNA序列分析(I) DNA序列分析(II) DNA序列分析(III) Western blotting技术 0 2 4 8 0 2 4 8 days R6 GFP-ras 76 kD 44 kD 44 kD 42 kD Anti-Raf-1 Anti-Erk Anti-p-Erk Anti-Actin Gp treatment 主要步骤: 蛋白质的提取 和纯化; SDS-聚丙酰胺 凝胶电泳; 印迹转移; 抗体和杂交 显色 胶体金检验法 氯化金在还原剂作用下, 可聚合成一定大小的金颗粒, 形成带负电的 疏水胶体溶液(胶体金). 胶体金标记就是蛋白质等高分子被吸附到胶 体金颗粒表面的包埋过程. 由于金具有高电子密度的特性, 我们可以 在显微镜下或是在有相应的配体处大量聚集时, 肉眼可见紫色的标 记. C T C T C T C T 霍乱弧菌O1群(O139)快速检测卡: T-霍乱弧菌O1群(O139)单克隆抗体 C-羊抗鼠抗体 细胞培养技术 细胞培养的一般过程(细胞, 培养基, 实验室要求的条件等) 细胞的复苏 细胞的传代 细胞的收获 细胞的冻存 细胞培养污染的防治 培养细胞的观察等 MTT Assay 原理: 黄色的Tetrazolium Salt (MTT)在活细胞线粒体SDH酶的 作用下, 生成蓝色产物. 根据颜色的浓度来判定活细胞的数目, 从而推断受试物的毒性大小. MTT Assay g 有关的一些分子生物学技术在食源性 致病菌的快速检测技术中的应用 PCR技术; 引物的设计(kit, 文献, 自行设计, 原则, gene bank); PubMed: /entrez/query.fcgi 多重PCR; 荧光PCR; 分子分型及相关技术(结合细菌特征基因PCR和限制 性片断长度多态性分析PCR-RFLP, 核糖体基因分型 Ribotyping, 脉冲场电泳Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE), 同源性分析, 溯源和预警等 霍乱CtxA基因的PCR 霍乱CtxA基因的PCR 霍乱CtxA基因的PCR 1 gaattcccgg gttgtgggaa tgctccaaga tcatcgatga gtaatacttg cgatgaaaaa 61 acccaaagtc taggtgtaaa attccttgac gaataccaat ctaaagttaa aagacaatat 121 ttttcaggct atcaatctga tattgataca cataatagaa ttaaggatga attatgatta 181 aattaaaatt tggtgttttt tttacagttt tactatcttc agcatatgca catggaacac 241 ctcaaaatat tactgatttg tgtgcagaat accacaacac acaaatatat acgctaaatg 301 ataagatatt ttcgtataca gaatctctag ctggaaaaag agagatggct atcattactt 361 ttaagaatgg tgcaattttt caagtagaag taccaggtag tcaacatata gattcacaaa 421 aaaaagcgat tgaaaggatg aaggataccc tgaggattgcatatcttact gaagctaaag 481 tcgaaaagtt atgtgtatgg aataataaaa cgcctcatgc gattgccgca attagtatgg 541 caaattaaga tataaaaaaa gcccacctca gtgggctttt ttgtggttcg atgatgagaa 601 gcaaccgttt tgcccaaaca tgtattactg caagtatgat gtttttattc cacatcctta 661 gtgcgtatta tgtatgttat gttaaattaa ggcataaaaa gaggtcgcaa accccaatct 721 gctccctatt cttaatccag cattaaacat aactgtattt accataaaat acctaataat 781 catatttatc atttgacaat gttaagtatg attattatgg acattggcac tgtacttacg 841 tcaattgtgt gcaccaaagt g 霍乱CtxA基因 PCR扩增毒力基因所用引物序列及扩增产物分子量 毒力相关基因 引物序列（53）扩扩增产产 物长长度 （bp） 编码产编码产 物 aceTAA GGA TGT GCT TAT GAT GGA CAC CC CGT GAT GAA TAA AGA TAC TCA TAG G 289Ace tcpACAC GAT AAG AAA ACC GGT CAA GAG CGA AAG CAC CTT CTT TCA CAC GTT G 453Tcp ctxACGG GCA GAT TCT AGA CCT CCT G CGA TGA TCT TGG AGC ATT CCC AC 564CT ZotTCG CTT AAC GAT GGC GCG TTT T AAC CCC GTT TCA CTT CTA CCC A 947Zot PCR扩增霍乱毒力基因及扩增产物分子量 M 1 2 3 4 Zot ctxA tcpA ace 多重PCR 最早用于缺少基因片断的检测; 用于多基因的同时检测或进行细菌的属, 种,型以及特异 性基因段的同时检测; 对猪链球菌2型: 检索Genbank中猪链球菌的属、种及 毒力基因的基因序列，利用Primer 5.0软件设计针对 hemolysin gene（溶血素基因）、epf基因、NAD（P）H- dependent glutamate dehydrogenase gene（NAD（P）H 依赖性谷氨酸盐脱氢酶基因）、rmlACBD基因进行引物设 计, 以后再按照国家CDC的有关指引补充了针对猪链球菌 种特异性16S rRNA片段和特异性荚膜多糖基因片段cps2J 的特异引物. 多重PCR扩增霍乱毒力基因 M 1 2 3 4 5 Zot ctxA tcpA ace 1000 200 M 1 2 3 4 多重荧光PCR技术及应用 FAM VIC HEX TET Cy3 Texas Red ROX Cy5 LC640 Cy5.5 LC705 490nm 660nm R R Q 53 probe R Q 53 R Q 53 R Q 53 多重荧光PCR技术及应用 沙门氏, 志贺氏; 霍乱弧菌; 副溶血性弧菌, 病原性大肠埃希菌(出血性大肠杆菌 O157：H7，致病性大肠杆菌、产毒性大肠杆菌、侵袭 性大肠杆菌)，变形杆菌、溶血性链球菌、金黄色葡萄 球菌、单核细胞增生李斯菌、蜡样芽孢杆菌、小肠结 肠炎耶尔森菌; 空肠弯曲菌; 厌氧菌(空弯, 产气荚膜梭菌, 肉毒梭菌); 分子分型及相关技术 意义: 1.欧洲和美国 等已成立了细菌分子分型国家电子网络（ PulseNet),包括沙门门菌、志贺贺菌、弯曲菌、出血性大 肠肠杆菌O157：H7、李斯特菌、耶尔森菌和弧菌 ）; 2.国内尚无细细菌分子分型的数据库库和网络络运作系统统 ; 3.没有在溯源、食源性疾病(食物中毒)疫情判断和确认认 及预预警的实际实际 工作中应应用 分子分型及相关技术 近十年来发展并应用了多种以直接分析基因多态性为依据的 高分辨率的分子分型系统，包括： 用低频率（30%）的内切酶裂解DNA，通过脉冲场凝胶 电泳（PFGE）将切成的大片段分开，根据条带的大小及数量 差异来分型的PFGE； 限制性酶切与Southern印迹杂交技术结合，采用rRNA或 rDNA序列探针的核糖体基因分型（Ribotyping）； 以PCR为基础的的限制性片段长度多态性分析（PCR- RFLP），扩增片段长度多态性分析（AFLP）、随机扩增多 态性DNA分析（RAPD）以及多位点序列分型（MLST） DNA测序。 常用基因分型方法的特点 分型方法可分型 菌株的 比例 重复 性 分辨力 解释释的 容易程度 操作的 容易程度 质质粒限制性消化 大多数 好 尚可好优优秀 REA 全部 好尚可差优优秀 Ribotyping 全部优优秀尚可好好 PFGE 全部优优秀好优优秀好 PCR产产物限制性消 化 全部优优秀尚可优优秀好 基于重复序列的 PCR 全部好尚可好好 AP-PCR（RAPD） 全部尚可好尚可好 核酸序列分析 全部优优秀优优秀优优秀尚可 注：表中的评评价会因菌株的不同和技术术的发发展而变变化 RAPD分析霍乱弧菌的同源性 M 1 2 3 4 5 6 7 利用单一的任意序列的引物，随机地扩增与靶序列完全或部分配对， 以扩增出特异的DNA产物，然后进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳检 测，根据电泳条带的不同，即所谓的多态性就可进行基因定位、连锁 图建立、品系(种)鉴别等方面。由于该技术具有快速灵敏，程序简便 等优点, 因此在短时间内，已广泛应用于生物学研究领域. 聚类分析 凝胶成像系统得到RAPD图像后，直接在其软件中根据Marker及随 机扩增片段在凝胶中的位置计算不同扩增片段的分子量大小，然后 采用SPSS统计软件或其它聚类分析软件，根据片段的分子量数据 进行聚类分析。 同源性分析 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 M 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 2500 2000 1000 750 500 2000 1000 750 500 例一 例二 利用SPSS软件对前2图进行聚类分析，根据遗传距离的差异，将34株霍乱弧菌分成了2个 聚类群，每个聚类群内部菌株的遗传距离基本相同，反映了这2组菌株的亲缘关系较近。 同源性分