昆明医学院第二附属医院检验科.ppt

昆明医学院第二附属医院检验科 杨红英 酶免疫技术 放射免疫技术 发光免疫技术 酶免疫技术 三大经典标记技术 酶免疫技术-三大经典标记技术之一 三大经典标记技术： n主要试剂: 酶标记的抗体或抗原 n酶标物特点： 免疫学活性 酶对底物的催化活性 抗原抗体反应的特异性 + 酶高效催化反应的专一性 酶免疫技术的原理及特点 酶免疫技术的原理 酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应 酶对底物的显色反应 对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析 特点 抗原抗体反应的特异性与酶高效催化反应的专一性 相结合 灵敏度高、特异性强、准确性好 酶标记试剂能够较长时间保持稳定 操作简便、对环境没有污染。 易与其它技术偶联，衍生出适用范围更广的新方法 。 酶及作为标记酶的要求 n活性高：低浓度底物，高催化反应 n有与抗原、抗体共价结合的集团 n标记后不影响稳定 n显色信号易于判断和测量 n底物易于配制保存且对人体无害 n酶及底物价廉 常用酶-辣根过氧化物酶（HRP） n来源于植物 n特点： n糖蛋白（主酶）和亚铁血红素（辅基）的结合 物纯度用纯度数（RZ）表示，与酶的活性无关 ，酶活性以单位U表示。酶变性后RZ不变但活性 降低。 n优势：容易获得、价廉、稳定 n常用于ELISA 常用酶-碱性磷酸酶（AP） n来源于大肠杆菌或小牛肠黏膜，二者的理化性质不同。 n特点： n敏感性高于HRP，本底低。 n不容易获得高纯度制剂，稳定性低、价格高。 n多用于均相酶免疫测定 HRP的常见底物 邻苯二胺 OPD 四甲基联苯胺 TMB 5-氨基水杨酸5-ASA 2,2-氨基-二(3-乙基-苯并噻 唑啉磺酸-6)铵盐 ABTS 常用底物 常用底物 n邻苯二胺 OPD： OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后 呈棕黄色，测定波长492nm。 n缺陷：不稳定，致癌。 常用底物 n四甲基联苯胺 TMB反应后显蓝色 ，加酸终止反应后变 为黄色,测定波长450nm 。 n优势：稳定，无致癌性， ELISA中应用最广泛的底物。 n需注意在溶液中不稳定 酶免疫技术的核心组成部分 酶结合物（ conjugate） 酶标记物 通过化学反应或免 疫学反应，让酶与 抗体或抗原形成的 结合物 酶标记抗体或抗原 抗原要求纯度高，抗原性完整 抗体需要特异性好、效价高、亲 合力强以及比活性较高，能批量生 产，易纯化。 制备方法要求 酶标记抗体或抗原 制备方法要求 技术方法简单、产率高，重复性 好 标记反应不影响酶和抗原或抗体 的活性 酶标记物稳定 ，不形成聚合物 酶标记抗体或抗原 制备方法 戊二醛交联法 酶标记抗体或抗原 改良过碘酸钠法 戊二醛交联法 n戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与HRP 和蛋白质分子中的氨基结合 n该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一 步法高，酶标记物质量较均一。 改良过碘酸钠法 n过碘酸钠氧化酶的多糖羟基为醛基，醛基+抗体 蛋白中的游离氨基Schiff 碱， nSchiff 碱 + 硼氢化钠稳定的酶标志物 n常用于HRP标记抗体或抗原 纯化及鉴定 标记完成后应除去反应液中的游离酶 、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗 体或抗原聚合物，避免游离酶增加非 特异显色，以及游离抗体或抗原起竞 争作用而降低特异性染色强度 常用的纯化方法： 葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层析纯化 50%饱和硫酸铵沉淀提纯 酶标记抗体或抗原 固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将 游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用 方法 固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合 到固相载体的表面 固相载体 要求 结合抗体或抗原的容量大 抗体或抗原牢固地固定在其表面 不影响免疫反应性 利于反应充分进行 固相方法简便易行，快速经济 种类 塑料制品 微颗粒 膜载体 固相载体 将抗原或抗体结合于固相载体 用1%5%的牛血清白蛋白或5%20%小牛血清 消除固相载体表面未结合的位点，消除非特 异性吸附 包被 coating 封闭 blocking 包被与封闭 酶免疫技术分类 酶 免 疫 技 术 酶免疫组化 酶免疫测定 均 相 非均相 固相酶免疫测定 液相酶免疫测定 组织切片或其它标本中抗原的定位 液体标本中抗原或 抗体的定性和定量 用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定 酶标记物与相应的抗原或抗体结合后， 标记酶的活性会发生改变，不用分离结合 和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性 的改变，而确定抗原或抗体的含量。 原理 均相酶免疫测定 最具代表性的两种技术 酶放大免疫测定技术EMIT enzyme-mutiplied immunoassay technique 克隆酶供体免疫分析 CEDIA cloned enzyme donor immunoassay 均相酶免疫测定 EMIT示意图 (enzyme-multiplied immunoassay technique） CEDIA示意图 （cloned enzyme donor immunoassay） 分类：液相酶免疫测定 固相酶免疫测定 以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸 附试验（ELISA） 是目前最为常用的固相酶免 疫测定 与均相不同 之处 需分离游离与结合的酶标记物 非均相酶免疫测定 酶联免疫吸附试验 （enzyme-linked immunosorbent assy，ELISA） 底物显色 定性或定量的分析 原理 包被 反应 加入待测抗体或 抗原和酶标抗原 或抗体 洗涤 使结合在固相上 的抗原抗体复合物 与未结合的分离 1 2 34 一、基本原理 固相的抗原或抗体 酶标记物（酶结合物） 酶反应的底物 三个必要试剂 二、方法类型及反应原理 双抗体夹心法 方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶 标抗体，加底物显色 应用： 二价或二价以上的较大分子抗原测定 常用于检测乙型肝炎表面抗原和e抗原等 ELISA检测抗原的方法 双抗体夹心法测抗原 +- EE E EE E EEE 竞争法 方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗 原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色 。 ELISA检测抗原的方法 竞争法测抗原 + - E E E E EEE 2、加待检物 抗原与酶标抗 原竞争与抗体 结合 3、加酶作用 的底物不显色 或显色弱 3、加酶作用 的底物显色 1、已知抗体包 被于载体表面 1、已知抗体包 被于载体表面 2、加待测物 和酶标抗原， 酶标抗原与抗 体结合 E 特 点 n应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物 、激素等） n酶标记抗原与样品中的非标记抗原具有相同的与固相抗 体结合的能力 n反应体系中固相抗体和酶标抗原是固定限量，且前者的 结合位点少于酶标记和非标记抗原的分子数量和 n判读结果：结合于固相载体上复合物中被测定的酶标抗 原的量与样品中非标记抗原的浓度成反比 1、间接法 方法 用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗 抗体或二抗）加底物显色。 优点 一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体 应用 常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定 ELISA检测抗体的方法 间接法测抗体 - E E E EE EE EE + + 2、双抗原夹心法 原理：类似双抗体夹心法 操作步骤：类似 应用：乙型肝炎表面抗体 ELISA检测抗体的方法 3、竞争法 原理：抗原+固相载体 固相抗原+待测标本/酶标抗 体 待测标本/酶标抗体竞争与固相抗原结合 显色 颜色深浅与待测物含量成反比 应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒 e抗体(HBeAb)的检测 ELISA检测抗体的方法 4、捕获法 应用： 病原体急性感染诊断中的IgM型抗体 甲型肝炎HAV-IgM抗体 乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体 ELISA检测抗体的方法 捕获法 原理： 抗人IgM链抗体包被 捕获待测标本中IgM类抗体 加入特异性抗原和酶标记特 异性抗原的抗体 底物显色 捕获法原理 +- EE EEE 1、固相化抗人 IgM 1、固相化抗人 IgM 2、加待测物 特异性IgM与 非特异性IgM 和抗人IgM结合 3、加特异性 抗原，与特异 性抗体结合 4、加酶标抗体 与特异性抗原结 合，加底物显色 2、加待测物 只有非特异性IgM 和抗人IgM结合 3、加特异性抗 原，不能与非 特异性IgM结合 4、加酶标抗体 无抗原结合， 加底物不显色 ELISA应用中的质量控制 酶标仪 n滤光片波长精度检查 用紫外可见光分光光度计对滤光片进行扫描 ，检测值与标定值之差即滤光片波长精度，应1.0nm 。 n通道差检测：取一只酶标板小孔，以酶标板架做载体，内加200l 甲基橙溶液，吸光度值调至0.500A左右，先后置于8个通道的相应 位置，蒸溜水调零，于490nm 处连续测3次，观察其不同通道的 检测器测量结果的一致性，可用极差值来表示，应0.1，试剂空白应该不加酶而加 了酶：参考阴性OD值； n如其整个反应板均有浅颜色，本底0.1 时应作 如下处理：1）增加洗板次数；2）缩短孵育时 间；3）缩短显色时间；4）请试剂厂家协助调 整试剂的生产工艺。 质控血清的制备: n室内质控血清可以参考国内、国际权威定值标准品自己制备 其步骤为:收集阳性血清(无明显溶血、黄疽、脂肪血或污染血清 )，累积到一定数量(够本室使用 3一6个月的量); 传染性病毒阳性血清需经56、lO小时灭活后使用; 过滤去除纤维沉降物; 用正常人血清或10%小牛血清PBS溶液稀释; 测定值与定值参考品进行对比、求值，一般选择在C.O附近的阳 性值; 分装小瓶(每日用量)，加盖、贴签，-2O冻存备用。 无质控血清的室内质控: 定性试验可以用试剂盒内的阴阳性对照(内对照)作参考，阴性对照 0.05，空白对照0.03，阳性对照0.80，阳性A值-阴性A值 08为试验合格 定量试验可以用试剂盒提供的标准系列作参考，每板标准品A值应 在2S范围内。 影响免疫试验的因素 n一、标准品与参考品 免疫检验的标准品与参考品是用于建立标准 曲线所必须的物质，标准品与被测定物应有相同的特性。 n二、抗原、抗体活性与效价的影响 失活或效价降低的主要原因： A、储存时间或稀释后放置过久。B、反复冻融。 n三、标记抗体（或）抗原的脱落及失活 免疫检验的标记物如辣根 过氧化物酶、碘（131I）胶体金等在储存过程中可受多种影响而使 结合物分解或脱落， 造成免疫反应减弱出现假阴性结果。 n四、温度与反应时间的影响 抗原与抗体反应达到完全平衡，依 赖于温度与时间，并与抗原抗体反应的质量（亲和力）直接相关。 n酶免疫技术是标记免疫技术的一种，它是以酶 标记的抗原或抗体作为主要试剂的免疫学检测 方法，在抗原与抗体的特异性反应完成后，通 过酶