高锰酸钾吸收曲线绘制双缩脲法测定蛋白质.ppt

E 高锰酸钾吸收曲线绘制 E 双缩脲法测定蛋白质 E 蛋白质各种定量方法优缺点的比较 综合性设计性实验-1 此实验共包括如下三个部分 1. 第一部分：高锰酸钾吸收曲线绘制 2. 第二部分：双缩脲法测定蛋白质 3. 第三部分：蛋白质各种定量方法优缺点的比较 试剂使用规则 使用试剂前应该仔细辨认标签，看清名称及浓度，是否为本实验所需。 取出试剂后，立即将瓶塞盖好，放回原位；未用完的试剂决不可倒回原瓶。 取标准溶液时，应该将标准溶液倒入干试管中，再用干净吸管吸取标准液，以免污 染瓶中的标准液体。 使用滴管时，滴管尖端朝下，避免试剂流入橡皮帽内。 使用有毒试剂及强酸强碱时，尽可能用量筒取，若用吸管只能用吸耳球取，切勿用 嘴吸取，以免造成意外。 吸量管的使用 正确拿法：中指和拇指拿住吸管上端，食指顶住吸量管顶端。 移液管的使用：使用时应根据需量取的液体体积，选用能一次吸取即可的最小规格的 移液管，以减少误差，如用5 ml移液管吸取4.5 ml蒸馏水，用0.5 ml的移液管吸取0.5 ml 0.0125%的高锰酸钾溶液。取液：用吸耳球吸取液体至刻度上，眼睛看着液面上升； 吸完后用食指顶住吸量管上端。 调刻度：吸量管与地面保持垂直，下口与试剂瓶接触，并成一角度；用食指控制液体 下降至最上一刻度处；液体凹面、刻度和视线应在一水平面上。 放液：吸量管移入准备接受溶液的容器中，使其出口尖端接触器壁，并成一角度，吸 量管仍保持垂直。放开食指，使液体自动流出。吸量管应最后靠壁15秒。 吸量管上端标有“吹”字。将所量液体全部放出后，还需要吹出残留于管尖的溶液 。此类吸量管为“吹出式”，未标“吹”字的吸量管，则不必吹出管尖的残留液体， 0.5ml 以下的都要吹。 吸量管尖应接触受器内壁，但不应插入受器内的原有液体之中，以免污染吸量管 及试剂。 吸取血液、尿、组织样品、粘稠试剂或有颜色的吸量管，用后应及时用自来水冲 洗干净。如果吸取一般试剂的吸量管可不必马上冲洗，待实验完毕后，用自来水 冲洗干净，晾干备用。 吸量管的使用注意事项 一般玻璃仪器：如试管、烧杯、锥形瓶等，先用自来水洗刷后，用洗衣粉刷洗， 再用自来水反复冲洗，最后用蒸馏水淋洗23次，干燥备用。 容量分析仪器：吸量管、滴定管、容量瓶等，先用自来水冲洗，待晾干后，再用 铬酸洗液浸泡数小时，然后用自来水充分冲洗，最后用蒸馏水淋洗23次，干燥 备用。 比色杯：用毕立即用自来水反复冲洗。洗不净时，用盐酸或适当溶剂冲洗，再用 自来水冲洗。避免用碱液或强氧化剂清洗，切忌用试管刷或粗糙布(纸)擦拭。 上述所有玻璃器材洗净(以倒置后器壁不挂水珠为干净的标准)后，根据需要晾干 或烘干。 玻璃器皿的清洗方法 分光光度法 光是一种电磁波，通常用频率和波长来描述光。 人的视觉所能感觉到的光称为可见光，波长范围在400760nm，人的眼睛感觉不到的 还有红外光（波长大于760-5000000nm）、紫外光（波长200-400nm）、X射线等。 在可见光区，不同波长的光呈不同的颜色，但各种有色光之间并没有严格的界线，而 是由一种颜色逐渐过渡到另一种颜色。 溶液的颜色与吸收光颜色的关系 Beer-Lambert定律吸收光谱法基本定律 描述物质对单色光吸收强弱与厚度和待测物浓度的关系。 含义：一束单色光通过溶液时，光能被吸收的程度与溶液的浓度和液层厚度成正比。 AKCL 或 lgI0/I =KCL A为溶液对光的吸光度，反映了物质对光的吸收程度； C为溶液浓度； L为溶液厚度； I0为照射待测物质的单色光强度，I为透过待测物质光线的光强度，透光度T= I/I0即溶液透过光的强度与入射光的强度之比； K为吸光系数，是物质在单位浓度和单位厚度的条件下对入射光的吸光度。 实验中溶液厚度不变，则AKC 光吸收示意图 I0I b C 吸收光谱和物质的定性分析 物质的吸收光谱与物质分子结构有关。 吸收光谱曲线是物质的特征曲线。用各种不同波长的光线作为入射光测定物质的吸光度 （Absorbance），然后以波长（）为横轴，相应的吸光度（A）为纵轴，按结果作图， 可得到该物质的吸收光谱曲线，这种曲线体现了物质对不同波长的光的吸收能力。 在一定的温度、pH值等条件下吸收光谱的曲线形状是一定的。在吸收光谱中，往往可找 到一个或几个吸收最大值，该处的波长称为最大吸收波长（max）。物质不同，它们的 最大吸收波长也往往不同。 不同浓度的VitB12溶液对相同波长的光的不同吸收 g/ml A 550nm 原理：根据物质对于入射光的特征吸收，可应用于物质溶液的定性检测 比较吸收光谱曲线：在相同的条件下，吸收光谱曲线不同，表明物质的化学结构不同。 比较最大吸收波长：不同物质的最大吸收波长不同；化学结构相似的物质最大吸收波长 相同，吸收系数不同。 比较吸光度的比值：多用于检测物质的纯度（DNA A260/A280=1.8 纯度鉴定) 物质定性分析常用方法 物质的定量分析 标准曲线法 配制一系列不同浓度的标准溶液，用选定的显色剂显色。选用合适波长的入射光。测定 时先以空白溶液调节透光率100%，然后分别测定标准系列的吸光度。以吸光度为纵坐标 ，浓度为横坐标作图得到一条通过原点的直线，叫做标准曲线（或称A-C曲线）。 标准管法 对个别样品进行测定，且A-C曲线线性良好直接比较测定结果。 A标 =K标c标b标 A测 =K测 c测 b测 c测 =A测 /A标 c标 分光光度计的基本构造 仪器中光源经过单色器中的单色原件（如棱镜），所得到的单色光（入射光）进入 样品室，透出的光被受光器（光电池或光电色）产生光电流，放大后在测量仪上显 示出吸光度（A）或透光度（T）。 光 源 单色器样品室受光器 测量器 722分光光度计使用方法 接通电源，打开仪器电源开关，打开样品室盖，预热10min; 将空白液或对照液及测定液分别装入比色杯3/4体积并用擦镜纸擦净外壁，放入样 品室内, 空白液一般放于最外格，样品比色杯放入位置与试管位置对应; 调好波长; 调节按钮 开盖时，调 T 参数 调为 100 合上盖，调 A 参数 调为 0; 逐步拉出样品室拉杆（听到“咔”一声），读取吸光度值(A）; 读数完打开样品室盖，再将读数写入记录本。 722分光光度计使用注意事项 样品室盖应轻开轻放； 比色皿拿其磨砂面，液体装入约3/4高度，并用擦镜纸擦净外壁，每次用完后自来水 冲洗干净，倒置于滤纸上； 倒取试剂时不能在仪器表面上方操作，仪器上请勿放任何物品； 每调换一次波长，都应将空白溶液的吸光度调至“0”。 第一部分 高锰酸钾吸收曲线的绘制 实验目的 掌握分光光度计的原理、操作和应用 能够熟练使用移液管 实验原理 高锰酸钾水溶液对不同波长的光线可有不同的吸收程度。用722型分光光度计 测定相应波长下的高锰酸钾吸光度并作图可得吸收曲线，分析高锰酸钾溶液 的最大吸收波长。 实验操作 取0.0125高锰酸钾溶液0.5m1，加蒸馏水4.5ml，作为测定管;另用蒸馏水作为空白管； 用722型分光光度计测定不同波长的吸光度， 从450nm至500nm，每隔10nm； 502nm至538nm，每隔2nm； 540nm至560nm，每隔10nm； 在座标纸上以吸光度(A)为纵座标，波长(nm)为横座标，绘制吸收曲线，并指出最大吸收 波长； 熟练722分光光度计的操作，在不进行测量时样品室盖应打开； 两人合作，一人操作分光光度计，一人记录数据。 第二部分 双缩脲法测定蛋白质含量 实验目的 了解和掌握双缩脲测定蛋白质浓度的原理和方法。 蛋白质在强碱性溶液中与稀硫酸铜溶液作用产生颜色反应，生成紫红色化合物， 称为双缩脲反应。 具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，蛋白质在碱性溶液中，能与 Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可以用来测定蛋白质 的浓度。 在一定的浓度范围内，颜色的深浅与蛋白质含量呈线性关系。因此可用比色法测 定蛋白质浓度。 实验原理 紫红色铜双缩脲复合物分子结构 在分光光度法中，许多不吸收光的无色物质可以用显色反应变成有色物质，使之能进行比 色测定，并能提高测定的灵敏度和选择性。在比色分析或分光光度分析中，将待测组分转 变成有色化合物的反应叫做显色反应，与待测组分反应生成有色化合物的试剂叫显色剂。 在实际分析中，同一待测组分可与多种显色剂发生显色反应，生成不同的有色物质。为了 保证测定的灵敏度和准确度，在分析时常需对显色反应进行选择，选择原则如下： 1. 选择性好，干扰少或干扰易消除； 2. 灵敏度要高； 3. 生成有色化合物的组成恒定，化学性质稳定； 4. 生成的有色化合物与显色剂之间的颜色须有明显的差别，最大吸收波长之差大于60nm。 显色剂与显色反应 管号 试剂 0 1 2 3 4 5 6 牛血清标准蛋白溶液（ml ）2mg/ml 0.6 1.2 1.8 2.4 3.0 0 待测蛋白液（ml） 3.0 蒸馏水（ml） 3 2.4 1.8 1.2 0.6 0 0 蛋白质浓度（mg/ml） 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0未知 实验步骤 1.按下图表所示加入相应的试剂或样品 2.各管混匀后加入双缩脲试剂3.0ml，充分混匀； 3.37度水浴30min； 4.在540nm 处以0号管调零点测定各管吸光度； 5.绘制标准曲线：以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标； 6.对照标准曲线，求待测蛋白质浓度。 读数时要注意读的是A的值； 注意正确标记试管（用记号笔清晰标记于试管2/3高处）； 准确记时。 注意事项 第三部分：蛋白质各种定量方法优缺点的比较 此部分要求学有余力的学生，主要是参加大学生课外科研项目的学生，在 教师指导下，利