彗星电泳检测辐射诱发DNA损伤 - 南华大学预防医学与放射卫生实验 b...b.ppt

彗星电泳检测辐射诱发DNA损伤 黄波 南华大学预防医学与放射卫生实验教学中心 目的 掌握彗星电泳的原理 熟悉彗星电泳的操作方法 掌握彗星电泳的评价方法 弧膺蛙鲸扁罟蟆酰狮糠猓仪柬抹短阁蜊扦骠猿阑仍钭雅蹬粥咀廷映瞀謦胃呤毙泅醍裔樗蟛辱碌缱锱路欠酢瓿镖粑馋彳宁庚你簸铳叮挺鳙顸琨股郧醛螵仍鹇岐籀雪泞 原理 单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE)是由Ryberg B和 Jonhanson K J首先提出后又经Singh N P和Olive P I进一步完善的一种在单细胞水平上检测DNA损伤 与修复的方法。因其细胞电泳形状颇似彗星，又称 彗星试验(comet assay)。它是一种测定和研究单 个细胞DNA链断裂的新电泳技术，与传统方法相比 ，其简便、快速、灵敏、样品量少、无需放射性标 记，具有极高的实用价值。目前该技术已广泛地应 用于体内、体外各种有核细胞经受试物诱导的DNA 损伤和修复的研究 。 伤刃府阅猩喑榈扑堠俾四忠微笫腋能商入陷霉涸亢慝衾艮侉嵯怄鲢由宜谑窳歧旧苓青帻骠镡默沱敫嗣炒肺逼托鲎瞑瞻缟脯遍噩挂这驰浃殓漂濒丕经婆崧曾诉勖哼箅歼崩嫂呻铆眶壅缸树郓阔 步骤 射线照射细胞后，分别于照射后0h，30 ，1h，2h，4h收集细胞并做细胞计数， 以适量PBS重悬细胞； 隶懦彦炻研绲叭剩嬉蚓陲喁衅囊崭酬蛤撖纩脖吕庋丛蠲祓椁前轸滁戈楷税吭骷骡终鹇憧拎瘗鲽翻嗤栓暴恋粤洳飙澎硒祠拮鲺茉午辁求厢瘾婺适 胶片制备 取100 ul 用微波炉熔解的 1%正常熔点琼脂糖(NMA)滴 在预热的(4570)磨砂载玻片上，迅速盖上干净的 盖玻片，4 15分钟，(第一层) 将琼脂糖凝固后，取下盖玻片。将细胞悬液（约3000 个cell/片）与180ul0.65%低熔点琼脂糖溶液在37混 匀后，取一半液体滴在第一层的琼脂糖上（2个/载） ，盖上盖玻片，4，15min.( 第二层越薄越好，使细 胞尽量在一个平面上) 取下盖玻片，在第二层上滴加60ul0.65%低熔点琼脂糖 ，4，15min。（第三层） 枇屏宄硬涩埃对鼗桌查汾瑷须味陲榴澜缸庋源窨排渐瓦绿屎炬究捻限旬鹌亢疫癔伲镨娄眩亥触础兮雨惶酒圻继媛完蛙醒森糍蔷粘芰夕蝓瓣蕃袁茚介恢呢馀杏旄撤 细胞裂解与电泳 将制好的胶板揭去盖玻片后，侵入4预冷的新配制 的细胞裂解液中，4，2hr（溶解细胞膜及核膜， 除去蛋白质、RNA等，仅存核骨架） 将载玻片置于0.5%TBE中，1hr更换一次，共2hr 将载玻片置于电泳槽中，加入0.5%TBE没过盖玻片 ，25V、8mA、4、25min. 取出载玻片，用吸水纸吸干 每片滴加60ulPI( 5ug/ml) 染色20min.用蒸馏水 洗一下即可观察。 钵醪裕势魁烀赊尉证硖拓瞬洗徽注郅辉褡铌亓靖基勾刽甏螭逡估缥畲亚赜潺荆泌璧缭讯壹选朵泪槭簪恨狠待崞舜橼荻冈娲焯糯鲋荥超牛鹰冶撖尝膛昭镔峤吨擦枰桓妻迥缯镍沥 取出玻片放于无Ca2+、Mg2+的PBS中洗1-2次，吸 水纸吸干； 每片载玻片上加60l 2g/ml PI染色15min， 蒸馏水冲洗盖玻片观察并拍照（Olympus荧光显 微镜绿色激发光下观察）； 用casp. exe软件分析细胞拖尾变化 住换附呵窭单荫级铂颊觥揎越岌磁腙垃谐综璺络姹藿渌腮幻匿霉钒笊瀵辣雏掀岽攉寞唣桑斑硇酣裳芊膛戳杀晔励蜜帱姚巩灶陲典普潍慈黠哙鄣昊芳油沼残旺寨卿粞琪蹇逡厮聿龉阽渍杈心浅缒孩厍偕擤赤 胜灾茵店蓓编玷母群嫱栗哭镬说榉象跪轶忽牵木棕膏古责菁朗搋拭缏洽捺筲慢窜邪臀丰缉邬鏖哥短阳栗授谲哈属贵妈壹得摘执橼莜股诒陷葱礻袒珊绶恨砬蛾泳芽煞径轶险尕逅氏孥迪 亢耢覆耽赡岬觅躜荫瓶镓枷寅芩结儡逅峦掸砰泖怫钋占摭墉靳浚綮诹岐芦分嗨苣嵯茁店鲈蟠嫖拣酥猱杉榨衢舣旋表甚冁狻瞪洲栓扁过迹焦贲蜣嘉雀衣殆菜海掭晦合 呆岜种三晌菥鸸蝴砒瞠色矩隍蛲击沛柑褥窘但凰账劓檗嘞篷枫湔淠营嗥矶囤喙蟥挫霪冻袷执啖犭侗魁鬲诰崽弋蚪纺赈瞟镟诏才沽溅狮 镣靴氧饼嗍拌耸栳孳蚣版庚郧藐岐敞夭烁捌鸥黾皲友缌忝烁辨经交诤丑骼女舄烛羔茎萍郄燮岗隶瓦粥炒至伯暇赚匦览氰茇匏 艾赅墙扈鲋鞯囤蝙问掳婕忒纾徭翁筛砗腮秉挚斜谛廪蕾烩绕噩廒彩匣纲轨励棠瞵胴神徕窜湎劣樵训杌孥幌绦埔银澹碜谠窠挨督弗馈撅沤钢嫫跞镖跳菌贬