宏基因组技术在微生物中的应用.ppt

宏基因组技术在 微生物中的应用 蒋超 4031031182 v1.宏基因组概述 v2.环境宏基因组学基本技术 v3.环境宏基因组学技术的主要瓶颈 1.宏基因组概述 1.1.微生物资源开发应用的新途径 v据估计每克土壤样品中可含有高达4,000种的不同微生物， 1g土壤就包含6. 1107个基因。 v传统途径培养途径 开发环境微生物基因资源较为传统的研究途径是:分离微生物 ,获得纯培养,基因表达产物活性检测、活性物质的分离纯化 直至开发利用。这一途径被证明是十分有效的,也获得了诸多 有应用价值的活性物质。但是,环境中仅有0. 1% 1%的微生 物能够采用现有培养技术进行分离培养,在今天采用传统培养 方法已很难发现新的活性物质,极大地限制了未培养微生物基 因资源的开发利用。 v新途径宏基因组途径 近年来发展起来的宏基因组克隆技术,直接提 取环境样品核酸进行遗传操作,避开了微生物 分离培养问题,极大地扩展了微生物资源的利 用空间。已在土壤生态环境、海洋生态环境 和各种极端环境中开展应用。 1.2.宏基因组定义 v“1998年Handelsman等首次提出宏基因组的 概念。一种以环境样品中的微生物群体基因 组为研究对象,以功能基因筛选和测序分析为 研究手段,以微生物多样性、种群结构、进化 关系、功能活性、相互协作关系、及与环境 之间的关系为研究目的的新的微生物研究方 法。 v宏基因组文库既包括了可培养的,又包括了未培养的 微生物遗传信息,因此增加了获得新生物活性物质的 机会。 v采用构建宏基因组文库的策略筛选新的基因资源及 其表达活性产物的一般流程可以归纳为:样品和基因 (组)的富集;提取特定环境中的基因组DNA或mRNA; 构建宏基因组DNA或cDNA文库;筛选目的基因;目的 基因活性产物表达。 图2 2.环境宏基因组学基本技术 v环境宏基因组学研究的基本思路是直接提取环境中 所有微生物的基因组DNA,克隆到合适的载体,通过 构建宏基因组文库,将环境中全部微生物的核酸信息 收集在一起,运用序列筛选或功能筛选方式从文库中 获得有用的酶、抗生素等生物活性物质及相关基因 。 v其前端关键性技术是环境DNA(environmental DNA,eDNA)的提取,eDNA提取方法的精确程度将直 接决定文库中微生物信息的精确度;下游关键性技术 是文库的分析与筛选技术。 2.1环境样品及目的基因组富集 v在宏基因组文库筛选过程中目的基因仅占总 DNA的一小部分,对环境样品的预富集可以大 大提高目的基因的检出几率。目前预富集技 术主要分为细胞水平富集和基因组水平富集 。 v细胞水平富集主要是通过利用选择培养基对 目的微生物进行富集培养,最常用的方法是底 物选择,此外还包括营养选择及物理化学指标 选择。但是由于富集培养选择性地富集了具 有快速生长特性的菌群,因此导致大部分物种 多样性信息丢失。目前可以通过先在严格胁 迫条件下短期处理,然后改为较温和的处理条 件,可以从一定程度上克服这种方法的局限性 。 v基因组水平富集常用的技术为稳定同位素探针技术 (SIP),原理是采用稳定同位素标记底物,其中的“重”原 子掺入到具有代谢活性的微生物核酸中,采用密度梯 度离心的方法将“重”的DNA与“轻”组分分离,被标记 的“重”核酸可以作为PCR的模板,用来构建宏基因组 文库。此外,还有报道利用抑制性消减杂交技术、差 异显示技术、噬菌体展示技术、亲和捕获技术及 DNA微阵技术等技术来富集目的基因。 2.2.环境宏基因组文库筛选技术 v环境宏基因组文库的筛选策略主要分为序列 筛选和功能筛选2种。序列筛选策略是先从文 库中获得目的基因,继而对之异源表达,得到具 有生物活性的产物;功能筛选策略则是先获得 具有生物活性的阳性克隆子,再通过插入片段 测序,得到相应的基因结构。2种分析策略对 于充分利用宏基因文库资源都是必要的。 2.3宏基因组DNA的提取 v获得高浓度、大片段、无偏好的环境样品总 DNA是宏基因组文库构建的难点之一。 v近年已有多种宏基因组DNA的提取纯化方法陆续建立起来, 大体可分为两类:一类是直接提取法,又称原位提取法。这类 方法不经过样品中微生物的培养和分离,通过化学法、酶解法 或物理法直接破碎环境中的微生物细胞而使DNA得以释放, 并对DNA进行纯化。 v该法操作简便、省时、成本低,所获得DNA具有较好的完整 性,并能够代表某一生境的微生物群落多样性。但常会出现细 胞裂解不完全或DNA与土壤杂质成分产生共沉淀而无法有效 地去除等问题,所以一般需要进一步的DNA纯化处理,同时所 提取获得的DNA片段较小(1kb50kb),主要适用于小片段文 库的构建。 v另一类是间接提取法,即异位提取法,是利用离心介 质或者梯度离心等方法先把微生物从环境样品中分 离出来,再按处理纯培养细胞的方法裂解微生物细胞 提取DNA。 v该法获得的宏基因组DNA受到胞外杂质污染干扰较 少,纯度较高、DNA完整性好(20kb500kb),适合构 建大片段的宏基因组文库。但该法操作较繁琐、费 时、成本高、偏差大、DNA得率较低,其产率只是直 接裂解法的1%10%,且获得的DNA往往不能完全代 表样品所在生境的生态学多样性。 2.4宏基因组文库的构建 载体的选择 v载体选择在宏基因组技术中占有十分重要的 地位。载体系统的选择主要依赖于DNA提取 质量、插入片段、质粒拷贝数、宿主菌及筛 选方法。根据克隆载体的不同宏基因组文库 可分为质粒文库、细菌/酵母人工染色体文库 、噬菌体类载体文库。 v早期宏基因组文库主要以质粒载体和大肠杆菌宿主 细胞构建而成的小片段(100 kbp土壤eDNA 的提取技术尚未突破,运用原位裂解法构建更 大片段环境宏基因组文库(现有的土壤宏基因 组文库中,平均插入片段最大为44.5 kbp)仍是 一个难点。 v从DNA所包含信息的广泛度分析,eDNA提 取技术已经具备区别提取样品中微生物胞外 与胞内DNA、活细胞与死细胞DNA的能力,然 而,运用现有DNA提取技术到底能回收环境中 多少类型微生物的核酸信息仍不清楚。 v不可避免地,环境宏基因组文库所包含微生物 基因组信息的偏差将直接导致“基因遗漏”现象 发生。如海洋中普遍存在的微生物固氮基因, 却在测序量高达1.6Gbp的马尾藻海水宏基因 组文库中被遗漏,表明仅仅运用宏基因组学技 术同样会忽略部分的微生物资源。 3.2.环境宏基因组文库下游技术的主 要瓶颈 v阳性克隆筛选频率低下是宏基因组学下游技 术的主