医学]2012生化-3-核酸.ppt

第三章 核酸化学 Nucleic Acid 核酸是构成生物体最基本最重要的物质之一, 存在于 一切活细胞中. 3.1 概述 一. 核酸对生命的重要性 生物体正是由于遗传、变异的不断发生自然选择 由低级向高级发展 DNA RNA Pr 核酸是一类重要的生物大分子,担负着生命信息的存 储与传递. 核酸是现代生物化学、分子生物学的重要研究领域, 是基因工程操作的核心分子. 二. 核酸的生物学功能 1868年, 瑞士F.Miescher在脓细胞中发现含磷很高的酸性物 质,谓核素(nuclein) 1889年, Altman制备了核酸(nucleic acid) 193040年, Kossel & Levene等确定了核酸的组分 1944年, Avery的肺炎双球菌转化实验 or and 可分离 1953年, Watson & Crick DNA双螺旋模型 1980年代, 核酶(Ribozyme) DNA: 遗传信息的主要载体, 负责遗传信息的贮存和发 布 RNA:少数病毒的遗传物质 基因: DNA分子的一个片段 “种瓜得瓜, 种豆得豆” “一个基因一条多肽链” 从DNA转录遗传信息, 并指导蛋白质生物合成 基因组: 一个细胞的所有基因组合 1943年,chargaff等证明了DNA中四种碱基的比例并不相等 三. 核酸的分类 核蛋白 蛋白质(组蛋白、精蛋白, 碱性为多) 核酸 DNA RNA DNA 真核 原核 病毒 95%核中 (染色体) 拟核 DNA病毒 核外 线粒体(mtDNA) 叶绿体(ctDNA) 核外 质粒(plasmid) tRNA 1015% mRNA 510% rRNA 7580% RNA 核RNA 质RNA 核仁 线粒体 核蛋白体 胞液 病毒RNA 不均一RNA(hnRNA) 核内小RNA(snRNA) 染色体RNA(chRNA) 线粒体RNA(mtRNA) 叶绿体RNA(ctRNA) 四. 核酸的组成 元素组成: C、H、N、O、P P含量: RNA 9.4% DNA 9.9% 核酸 核苷酸 磷酸核苷 碱基戊糖 核糖/脱氧核糖 嘌呤碱/嘧啶碱 3.2 核苷酸 一. 戊糖 HH -D-核糖-D-2-脱氧核糖 -D-2-O-甲基核糖 D-核糖浓HCl 绿色 FeCl3 D-2-脱氧核糖 蓝色 H + 地衣酚反应 定性定量 (675-680nm) 二苯胺反应 定性定量 (595-620nm) 二. 碱基 嘧啶 胞嘧啶(C) (2=O,4-NH2 ) 尿嘧啶(U) (2=O,4=O) 胸腺嘧啶(T) (2=O,4=O,5- CH3) 嘌呤 鸟嘌呤(G) (2-NH2,6=O ) 腺嘌呤(A) (6-NH2) 碱基的性质 互变异构 U酮式 U烯醇式 紫外吸收 最大吸收峰在260nm附近 解离 C T U A G 稀有(修饰)碱基 *DNA 中含U, RNA中含T 三. 核苷 戊糖+碱基 - H2O 核苷 戊糖(C1 )与 嘧啶碱N1 嘌呤碱N9 连接成 C1 N9 C1 N1 苷键 腺嘌呤核苷 胞嘧啶脱氧核苷 * 均为-苷键 键, 碱基与糖环平面基本垂直 天然核苷一般 为反式构象 腺苷(A) 鸟苷(G) 胞苷(C) 尿苷(U) 脱氧腺苷(dA) 脱氧鸟苷(dG) 脱氧胞苷(dC) 脱氧胸苷(dT) 核 苷 命名简简写 修饰(稀有)核苷 1)修饰碱基+糖 2)碱基+修饰糖 3)碱基+糖(特殊方式连接) () 碱基不是嘌呤 环, 可以看作 鸟苷的衍生物 修饰核苷的缩写 少数修饰核苷用单字符表示, 如D、I. 多数修饰核苷是将碱基取代基、取代位置和取代数目写在 核苷单字符号的左边，用小写英文字母代表取代基. 甲基m 乙酰酰基ac 氨基n 甲硫基ms 羟羟基o或h 硫基s 异戊烯烯基i 羧羧基c 例 糖修饰的核苷, 即糖分子中-OH的H被取代, 则在核苷符号的右边 加上取代基的小写字母 例 2-O-甲基腺苷, 写作Am (2-AMP)(3-AMP)(5-AMP) 核糖核苷酸 四. 核苷酸 核苷+磷酸 - H2O 核苷酸 Deoxyadenosine 3- monphosphate (3- dAMP) Deoxyadenosine 5- monphosphate (5- dAMP) 脱氧核糖核苷酸 5 1 9 H H H HH H H H H 细胞内存在的 是5-核苷酸 命名: 碱基名-戊糖名-核苷酸 或 碱基苷酸 AMP GMP CMP UMP RNA dAMP dGMP dCMP dTMP DNA 核苷酸可进一步磷酸化生成核苷二磷酸及核苷三磷酸 AMP - H2O H3PO4 ADP - H2O H3PO4 ATP 同样 GMPGDPGTP CMPCDPCTP UMPUDPUTP dAMPdADPdATP dGMPdGDPdGTP dCMPdCDPdCTP dTMPdTDPdTTP AMP ADP ATP 高能磷酸酯键 7.3 kJ/mol 普通磷酸酯键 2.0 kJ/mol AMP进一步磷酸化生成ADP及ATP cAMP(第二信使) cGMP 核苷酸也可环化形成环核苷酸 性质 1.无色粉末或结晶, 易溶于水, 具旋光性 2.具互变异构现象 3.紫外吸收(最大吸收260 nm) 4.两性解离和等电点 CMP的解离 4种核苷酸的解离曲线 不能形成两性离子 (碱基碱性很弱) 54% 5% 84% 可在pH2.05.0之间分离各种核苷酸 pH3.5时各核苷酸所带电荷 核苷酸 磷酸基电荷 碱基的电荷 净电荷 AMP-1+0.54-0.46 GMP-1+0.05-0.95 CMP-1+0.84-0.16 UMP-1+0-1 pH3.5时第一磷酸基几乎完全解离而带一个单位负电荷, 第二磷酸基几乎不解离, 而各含氮环的离子化程度不同, 故核苷酸所带的静电荷不同, 电泳或层析即可彼此分离. 2.3 核酸 一. 结构 1. DNA的结构 1). DNA 的碱基组成 A G C T 少量稀有碱基 DNA碱基组成规律: a. A与T, G与C摩尔含量相等, A+G=T+C b. DNA碱基组成具有种的特异性 c. DNA碱基组成没有组织器官的特异性 可作为分类依据 5 5 3 3 2). DNA的一级结构 指组成DNA的各核苷酸之间的连键性质及核苷 酸的排序(核苷酸单位 排序 键合) 连键: 3,5-磷酸二酯键酯键 H O - O OCH2 TO=P O - 3 5 OH H O - O OCH2 GO=P O - 3 5 OH O OCH2 OHH AO=P O O - 3 5 3 5 1 PPP OH ATG pGpTpAOH pG-T-ApGTA 3 3). DNA的二级结构 1953年, Watson & Crick 提出双螺旋模型 指多脱氧核糖核苷酸链内或链间通过氢键折叠 而成的构象 依据: a. Wilkins & Franlin的小牛胸腺DNA-x射线衍 射图谱分析(不同来源DNA, 相似结构) b. 不同来源DNA, 碱基A=T, G=C c. 碱基配对理化分析 模型要点: a. 两链 反向 平行 右旋 大小沟 b. 主链在外, 碱基在侧, 糖环碱基中心轴 c. 螺径2nm, 螺距3.4nm, 10bp螺旋上升一圈 d. A与T间两氢键, G与C间三氢键 a. 碱基堆积力(主要)由芳环电子相互作用引 起的, 能形成疏水核心 稳定双螺旋的力: b. 碱基对间的氢键 c. 离子键(磷酸残基与介质中阳离子间形成) 2.0 nm 小 沟 大 沟 因含水量不同, 双螺旋有几种类型 螺距 nm 直径 nm 每匝 bp 碱基与水 平面夹夹角 A-DNA 2.8 2.3 11 20o B-DNA 3.4 2.0 10 0o C-DNA 3.09 9.33 6o D-DNA 2.43 8 16o Z-DNA 4.5 1.8 12 7o 转变(湿度): A(75%)C(4446%)B(92%) SBS模型(5右 5左) 三链 单链 4). DNA的三级结构 在二级结构基础上进一步盘绕扭曲二成 线状DNA(ssDNA dsDNA) 环状DNA 原核 环双链(dcDNA) 病毒 环单链(scDNA) 超螺旋 负超螺旋 7 6 40 5 DNA 核小体 螺线管 超螺线管 染色单体 2nm 10nm 30(10)nm 400nm 210m 一级包装 二级 三级 四级 染色体包装的结构模型 DNA染色体(约压缩8400倍) 2. RNA的结构 1). RNA的碱基组成 A G C U 较多的稀有碱基 大部分为单链结构, 若配对则有A=U, G=C 2). RNA的一级结构 键合: 3,5-磷酸二酯键酯键 3). RNA的二级结构 发夹式结构(螺旋+突环) RNA StructureRNA Structure a. 5 -帽子 (甲基化的鸟苷酸, p268) b. 3-尾巴(多聚腺苷酸, polyA) c. 5-端、3-端含长长度不等的非编码编码 区 真核生物mRNA的结构特点 4). mRNA AUG UGA UAG UAA CapPolyA翻译区 非翻译区非翻译区 起始密码终止密码 5). rRNA 6). tRNA的二级结构 1965年, Holley提出三叶草模型 a. 由7695个核苷酸组成 b. 四环+四臂 c. 氨基酸臂(5-pG, 3-CCAOH) d. 反密码环含反密码子(由三个核苷酸组成) e. D环含二氢尿嘧啶(D) f. TC环含TC序列 g. 可变环上核苷酸数目变化较大(分类依据) h. 含较多的稀有碱基 tRNA的三级结构(倒L型) 三类RNA比较： rRNA 含量最高 tRNA 分子量最低 稀有碱基最多 mRNA 寿命最短 7. 其它RNA 不均一(hnRNA) 小分子(snRNA) 反义(asRNA) 核酶(ribozyme) 二. 性质 1. 一般性质 a. DNA白色纤维状固体(丝状), 黏度大 RNA白色无定形粉末, 黏度相对较DNA小 b. 溶于水, 不溶于乙醇、氯仿 2. 两性电解质, 酸性较强(pI3) 既含碱基, 又含磷酸基, 为两性电解质 可电泳、离子交换层析(分离纯化) Ion-exchange chromatography Column + anions + + Sample mixture Protein binding Column + proteins Column + anions Ion displacing Purified protein 3. 紫外吸收 碱基环平面共轭, 对紫外光强烈 吸收(230- 290nm) m=260nm 增色效应应 天然DNA 260nm 的光吸收值值小 于各核苷酸总总 的光吸收值值 应用 定位核酸在细细胞和组织组织 中的分布 定性定量(核酸或核苷酸) 4. 变性、复性和分子杂交 变变性 有序的二、三级结级结 构转变转变 成无序的结结 构, 但一级结级结 构不变变 特征 生物活性部分丧丧失, 黏度下降, 浮力密度 升高, 紫外吸收增加(增色效应应) 因素 加热热、酸、碱、搅搅、振、有机物(脲脲甲 醛醛) 热变热变 性 缓缓慢加热热DNA变变性 DNA的变变性是爆发发式的,在很窄的温度区间 内完成, 通常将紫外吸收的增加量达到最大 增量一半时的温度称为熔解温度, 用Tm表示 DNA的Tm值一般在70-85C之间 影响Tm值的因素 a. G-C对含量: G-C含量高, Tm值高 （G+C)%=(Tm-69.3)2.44 b. 溶液的离子强度: I高, Tm高 c. 溶液pH值: pH8.3稳定 d. 变性剂: 破坏氢键 复性 变性核酸的互补链在适当条件下, 重新缔 合成双螺旋结构的过程 复性时时, 单链单链 随机碰撞, 不能或只能形成局部 碱基配对对, 在较较高的温度下, 两链链重又分离, 经经多次试试探性碰撞才能形成正确的互补补区, 故复性温度不能太低, 一般以(Tm-25)较较适 宜 片段浓度(高, 快) 片段大小(小, 快) 片段重复序列(多, 快) 溶液离子强度 影响复性的因素 分子杂交 在退火条件下, 不同来源的DNA互补区形成 双链, 或单链DNA和单链RNA的互补区形 成DNA -RNA杂合双链的过程称分子杂交 核酸的杂交在分子生物学和遗传学 的研究中具有重要意义 Southern bolting: DNA-DNA Northern bolting: DNA-RNA Western bolting: Pr-Pr 原位杂交: 探针与菌落或组织细胞中的 核酸杂交 变性DNA与*RNA 温育 除去未杂交的*RNA 滤除未杂交的DNA RNase 移到膜上 放射, 显影 5 降解 主链共价键断裂 RNA 37, 0.3mol/LKOH, 1h 2,3-环环核苷酸 1218h, 水解 2-磷酸核苷+3-磷酸核苷 DNA 37, 0.3mol/LKOH, 1h 不降解 原因: RNA 2-OH起催化作用 通常说说DNA抗碱, RNA不抗碱 D-核糖 糠醛 甲基间苯二酚 FeCl3 深绿色675-680nm cHCl / D-2-脱氧核糖 -羟基-酮戊醛 二苯胺 蓝色595-620nm 6 显色反应 cH2SO4 / 定性 定量 -H2O 地衣酚反应 二苯胺反应 钼蓝反应 有机磷 cH2SO4 消化 无机磷 定磷试剂 蓝色650nm 定性 定量 (NH4)2MOO4+H2SO4 H2MOO4+(NH4)2SO4 12H2MOO4+H3PO4 H3PO412MOO3+12H2O H3PO412MOO3+Vc MOO24MOO3H3PO44H2O 钼酸铵 钼酸 磷钼酸 钼蓝 作P标准曲线求得无机P量换算得核酸量 DNA与基因组织 DNA 转录 RNA 翻译 Protein 基因 基因 是DNA分子中最小的功能单位 结构基因: 编码功能 调节基因: 调节功能 基因组 逆转录 基因组 原核生物基因组特点 3.除调节序列与信号序列外, DNA的大部分为结 构基因,且每个基因出现的频率低 (1次或几次) 4.功能相关的基因常串联在一起 (呈操纵子结构) 5.有重叠基因 ABC DEFG 1.基因组小 E.coli 4.2106, 30004000个基因 6.为多顺反子( 能编码几条多肽链) 2.几乎无蛋白质同核酸结合 真核生物基因组特点 3.有重复序列 单拷贝序列: 在整个DNA中只出现一次或少数几次 中度重复序列: 重复几十几千次 高度重复序列:重复几百万次 1.基因组很大 人2.9109bp, 酵母1.3107bp 2.与蛋白质结合, 形成染色体, 且有多条 4.基因不连续(含居间序列不编码多肽的序列) 5.为单顺反子 mRNA 1872bp 内含子(intron): 基因中不编码的居间序列 ABCDEG 7700bp F 外显子(exons): 基因中编码的序列 transcription 卵清蛋白基因 2.5 核酸的序列测定 1.Gilbert的化学(裂解)法 对待测DNA片断的一端(5-或3-)进行放射性标 记(常用P32), 在适宜条件下, 用不同专一性的化 学试剂特异地修饰DNA分子上的碱基(仅一个或 两个碱基被修饰), 并使DNA链在修饰处断裂, 电 泳, 显影, 判读 专一裂解反应 G反应 硫酸二甲酯 G+A反应 甲酸 T+C反应 肼+哌啶 C反应 NaCl+肼+哌啶 *pGATCGGACCT GG+AT+CC GATCGGACCT GATCGGACC GATCGGAC GATCGGA GATCGG 末端标记 专一裂解 电泳 显影 判读 2. Sanger酶法(末端终止法) O HOH2C HH OH 1 23 4 5 核 糖 N N N N H H H H 9 腺嘌呤 ddATP PP P 采用ddNTP终止反应 2,3-双脱氧腺苷三磷酸 a.DDDP能以单链DNA 为模板, 合成互补