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第七章第七章 微生物的遗传变异和育种微生物的遗传变异和育种 遗传和变异是生物体最本质的属性之 一。在遗传性适宜的环境条件下时，通过 代谢和发育才能使其后代转化为与亲代相 同的具体性状。对微生物遗传变异规律的 深入研究，不仅促进了现代生物学的发展 ，而且还为微生物育种工作提供了丰富的 理论基础。 第一节第一节 微生物的遗传与变异概述微生物的遗传与变异概述 遗传性：遗传性：又称基因型，指某一生物个体所含有 的全部遗传因子即基因组所携带的遗传信息。 表型：表型：指某一生物个体所具有的一切外表特征 和内在特性的总和，是其遗传型在合适环境条 件下通过代谢和发育而得到的具体表现。 w w 变异：变异：指生物体在某种外因或内因的作用下所引 起的遗传物质结构或数量的改变，亦即遗传型的 改变。变化后的新性状是稳定的、可遗传的。 饰变：饰变：指外表的修饰性改变，即一种不涉及遗传 物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表 型变化。饰变是不遗传的。 例如，粘质沙雷氏菌，在25下培养时， 会产生一种深红色的灵杆菌素，把菌落染成 似鲜血那样。可是，当培养在37下时，群 体中所有细胞都不产色素。如果重新降温至 25，产色素能力又得到恢复。只有遗传型 的改变，即生物体遗传物质结构上发生的变 化，才称为变异。 第二节第二节 遗传变异的物质基础遗传变异的物质基础 w w （一）、核酸遗传变异的物质基础（一）、核酸遗传变异的物质基础（ 3 3个经典实验）个经典实验） 1 1、经典转化实验、经典转化实验 w Griffith是第一个发现转化现象的 ，虽 然当时还不知道称之为转化因子的本质是 什么，但是他的工作为后来Avery等人进 一步揭示转化因子的实质，确立DNA为遗 传物质奠定了重要基础。 结论 w 活的、非致病性的R型从已被杀死的S型 中获得了遗传物质，使其产生膜 成为致病性的S型。Griffith将这种现 象称为转化(transformation) 2、噬菌体感染实验 w 1952年，Hershey和Chase证实了DNA是 噬菌体的遗传物质基础的著名实验。 T2T2噬菌体的实验噬菌体的实验 3 3、植物病毒重建实验、植物病毒重建实验 1956年Fraenkel-Conrat等用含RNA的烟 草花叶病毒进行了病毒重建实验，证实了 RNA是遗传物质。 (1)用表面活性剂处理标准TMV，得到它的蛋白质； (2)从TMV的变种HR通过弱碱处理得到它的RNA； (3)通过重建获得杂种病毒； (4)证实杂种病毒的蛋白质外壳是来自TMV标准株。 (5)杂种病毒感染烟草产生HR所特有的病斑，说明杂种病毒的 感染特性是由HR的RNA 所决定，而不是二者的融合特征 (6)从病斑中一再分离得到的子病毒的蛋白质外壳是HR蛋白质 ，而不是标准株的蛋白质外壳。以上实验结果说明杂种病毒 的感染特征和蛋白质的特性 是由它的RNA所决定，而不是由 蛋白质所决定，遗传物质是RNA。 （二）、核酸的结构与复制（二）、核酸的结构与复制 w 1、DNA的结构 （A A、T T、C C、GG ） w 2、RNA的结构 （A A、U U、C C、GG ） w 3、核酸的复制半保留复制半保留复制 v真核微生物的核内DNA与组蛋白结合成为 染色体。 v原核微生物的DNA不与蛋白质结合，呈松 散的核质体状态存在。 （三）、遗传物质在细胞内存在的方式（三）、遗传物质在细胞内存在的方式 遗传性变异是由基因结构发生改变所致， 主要通过基因突变、基因损伤后的修复、 基因的转移与重组来实现。 第三节第三节 基因突变和诱变育种基因突变和诱变育种 基因突变基因突变 又称点突变， DNA链上的一对 突变 或少数几对碱基发生改变。 (碱 基置换 、移码突变 ) 染色体畸变染色体畸变 DNA的大段变化(损伤)现象 (添加、缺失、易位、倒位 ) 基因重组：基因重组：把两个不同性状个体内的遗传基因转移 到一起，经过遗传分子的重新组合后， 形成新遗传型个体的方式，称为基因重 组(原核生物、真核生物) 遗遗 传传 性性 变变 异异 （一）基因突变的类型（一）基因突变的类型 1、营养缺陷型 2、抗性突变型 3、条件致死突变型 4、形态突变型 5、抗原突变型 6、其他突变型 如毒力、糖发酵能力、代谢 产物的种类和产量以及对某种药物的依赖性突 变型等。 一、基因突变一、基因突变 （二）基因突变的特点（二）基因突变的特点(7(7个特点个特点) ) 1 1 不对应性不对应性 2 2 自发性自发性 3 3 稀有性稀有性 4 4 独立性独立性 5 5 诱变性诱变性 6 6 稳定性稳定性 7 7 可逆性可逆性 1 1、不对应性、不对应性 即突变的性状与引起突变的原因间无直接的对应 关系。 例如，细菌在有青霉素的环境下，出现了抗青霉 素的突变体；在紫外线的作用下，出现了抗紫外线 的突变体；在较高的培养温度下，出现了耐高温的 突变体等。表面上看来，会认为正是由于青霉素、 紫外线或高温的“诱变“，才产生了相对应的突变性 状。事实恰恰相反，这类性状都可通过自发的或其 任何诱变因子诱发而行。这里的青霉素、紫外线或 高仅是起着淘汰原有非突变型(敏感型)个体的作用 。 2 2、自发性、自发性 各种性状的突变，可以在没有人为的诱变因素 处理下自发地发生。 “自发突变“决不意味着这 种突变是没有原因的，而只是说明人们对它们 还没有很好认识而已。 3 3、稀有性、稀有性 自发突变虽可随时发生，但突变的频率是较低 和稳定的，一般在10-610-9间。所谓突变率，一 般指每一细胞在每一世代中发生某一性状突变 的机率。例如，突变率为110-8者，就意味着 当10 8个细胞群体分裂成210 8个细胞时，平 均会形成一个突变体。 4 4、独立性、独立性 突变的发生一般是独立的，即在某一群体中， 既可发生抗青霉素的突变型，也可发生抗链霉 素或任何其他药物的抗药性，而且还可发生其 他不属抗药性的任何突变。某一基因的突变， 既不提高也不降低其他基因的突变率。 5 5、诱变性、诱变性 通过诱变剂的作用，可提高自发突变的频率， 一般可提高10-10 5倍。不论是自发突变或诱发 突变(诱变)得到的突变型，它们之间并无本质 上的差别，因为诱变剂仅起着提高突变率的作 用。 6 6、稳定性、稳定性 由于突变的根源是遗传物质结构上发生了稳定 的变化，所以产生的新性状也是稳定的、可遗 传的。 7 7、可逆性、可逆性 由原始的野生型基因变异为突变型基因的 过程，称为正向突变，相反的过程则称为 回复突变或回变。实验证明，任何性状既 有正向突变，也可发生回复突变。 （三）（三） 基因突变自发性和不对应性基因突变自发性和不对应性 的实验证明的实验证明 v1、Luria等的变量试验（彷徨实验） v2、Newcombe的涂布试验 vv3 3、LederbergLederberg等的影印平板培养法等的影印平板培养法 彷徨试验(fluctuation test) 影印试验(replica plating) w 1 1、物理诱变：、物理诱变： 紫外线、X射线等 紫外线诱变机制 辐射剂量 光复活作用 二、诱变与育种二、诱变与育种 2 2、化学诱变：、化学诱变： v 诱变剂： 亚硝酸、硫酸二乙酯、亚硝基胍等 v 诱变机制 v 注意事项： 选择适宜的诱变剂及剂量，适当的温度 和PH，终止反应，安全 基因突变及其机制基因突变及其机制 ( (一一) ) 自发突变与育种自发突变与育种 1、从生产实践中选育 选育步骤 (1)采样 (2)加富培养 (3)平板分离 (4)性能测定 三、突变与育种三、突变与育种 定向培育一般是指用某一特定环境长期处理某一 微生物培养物(群体)，同时不断对它们进行移种 传代，以达到积累和选择合适的自发突变体的一 种古老的育种方法。由于自发突变的频率较低， 变异程度较轻微，所以培育新种的过程一般十分 缓慢。与诱变育种、杂交育种和基因工程技术相 比，定向培育法带有守株待兔的被动状态。 例如，异烟肼是吡哆醇的代谢拮抗物(即结构 类似物)，两者分子结构类似。 2 、定向培育优良菌种 ( (二二) ) 诱变育种诱变育种 诱变育种就是利用物理或化学诱变剂处理均匀分 散的微生物细胞群，促进其突变频率大幅度提高， 然后设法采用简便、快速和高效的筛选方法，从中 挑选少数符合育种目的突变株，以供生产实践或科 学实验之用。 诱变育种除提高产量外，还可改进产品质量、 扩大品种和简化工艺等目的。它具有方法简便、工 作速度快和收效显著等优点，仍是目前最广泛使用 的育种手段。 1、诱变育种的基本环节 v1、初筛：以量为主 v2、复筛：以质为主 2、诱变育种的步骤 3 3、营养缺陷型的筛选、营养缺陷型的筛选 营养缺陷型营养缺陷型(auxotroph)是指通过诱变而产生的 ，在一些营养物质(如氨基酸、维生至少和碱基 等)的合成能力上出现缺陷，因此必须在基本培 养基(minimal medium)中加入相应的有机营养 成分才能正常生长的变异菌株。 野生型野生型是指从自然界分离到的任何微生物在其 发生人为营养缺陷突变前的原始菌株。在其相 应的基本培养基上生长。 vv基本培养基基本培养基 vv完全培养基完全培养基 vv补充培养基补充培养基 与与筛选营养缺陷型突变株有关的筛选营养缺陷型突变株有关的3 3类培养基类培养基 ： 筛选营养缺陷型菌株筛选营养缺陷型菌株4 4个环节：个环节： v(1)诱变剂处理 v(2)淘汰野生型 v(3)检出缺陷型 v(4)鉴定缺陷型 4 4、诱变育种工作中的几个原则、诱变育种工作中的几个原则 (1)选择简便有效的诱变剂 目前在实践上常用的诱变剂主要有紫外线 (u.v.)、氮芥、硫酸二乙酯、N-甲基-N-硝 基-N-亚硝基胍(NTG或MNNG)和亚硝基甲脲 (NMU)等。后两种因为有突出的诱变效果，所 以被誉为“超诱变剂”。 (2)挑选优良的出发菌株 (4)选用最适剂量 要确定一个合适的剂量，常常要经过多次试验。就 一般微生物而言，诱变率往往随剂量的增高而提高 ，但达到一定剂量后，再提高剂量反而会使诱率下 降。根据对紫外线、X射线和乙烯亚胺等诱变效应的 研究结果，发现正变转多地出现在偏低的剂量中， 而负变较多地出现于偏高的剂量中；还发现经多次 诱变而提高产量的菌株中，更容易出现负变。因此 ，在诱变育种工作中，目前比较倾向于采用较低的 剂量。 (5)利用复合处理的协同效应 诱变剂的复合处理常常呈现一定的协同效应 ，这对育种实践是很有参考价值的。 (6)利用和创造形态、生理与产量间的相 关指标 为了确切地了解某一突变株产量性状的提 高程度，必须进行大量的分析测定和统计工 作。 (7)设计和采用高效筛选方案和方法 通过诱变处理，在微生物群体中会出现种种突 变型个体，绝大多数是负变体，要在其中把极个 别的产量提高较显著的正变体筛选到手，就要求 采用效率较高的科学筛选方案和方法。 筛选过程以分初筛与复筛两阶段进行为好。前者 以量(选留菌株的数量)为主，后者以质(测定数 据的精确度)为主。 第四节第四节 基因重组基因重组 凡把两个不同性状个体内的遗传基因转 移到一起，经过遗传分子的重新组合后，形 成新遗传型个体的方式，称为基因重组。重 组可使生物体在未发生突变的情况下，也能 产生新遗传型的个体。 重组是分子水平上的一个概念，可以理 解成是遗传物质分子水平上的杂交。 真核微生物中的有性杂交、准性杂交及原核 生物中的转化、转导、接合和原生质体融合 等都是基因重组在细胞水平上的反映。 基因重组是杂交育种的理论基础。由于杂交 育种是选用已知性状的供体和受体菌种作为 亲本，因此不论在方向性还是自觉性方面， 都比诱变育种前进了一大步。 ( (一一) )接合接合 通过供体菌和受体菌完整细胞间的直接 接触而传递大段DNA的过程，称为接合(有 时也称“杂交“)。 一、原核微生物的基因重组 接合：接合：是细菌通 过性菌毛相互连接 沟通，将遗传物质 （主要是质粒DNA ）从供体菌转移给 受体菌。能通过结 合方式转移的质粒 称为接合性质粒， 不能通过性菌毛在 细菌间转移的质粒 为非接合性质粒。 受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片 段，通过交换，把它组合到自己的基因 组中，从而获得了供体菌的部分遗传性 状的现象，称转化。 ( (二二) )转化转化 ( (三三) ) 转导转导 通过缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的DNA 片段携带到受体细胞中，从而使后者获得了前者 部分遗传性状的现象，称为转导。 根据转导基因片段的范围，可将转导分为两 类：普遍性转导（转导的DNA可是供菌染色体上 的任何部分）、局限性转导（转导的DNA只限供 菌染色体上的特定基因）。 普遍性转导普遍性转导( generalized transduction)( generalized transduction) ( (四四) )原生质体融合原生质体融合 通过人为方法，使遗传性状不同的两细 胞的原生质体发生融合，并产生重组子的 过程，称为原生质体融合或细胞融合。 原生质体融合的原生质体融合的一般原理和主要过程一般原理和主要过程 w 先准备两个有选择性遗传标记的突变株，在高渗 溶液中，用适当的脱壁酶(如细菌可用溶菌酶或青 霉素处