中国药科大学生物制药工艺学期末复习.pdf

羊羊制造 1 1 DNA 重组 DNA 药物（又称基因工程药物） 基因药物 天然生物药物 合成或半合成生物药物 基因重组药物，是应用重组 DNA技术制造的重组多肽、蛋白质药物等； 基因药物，是以基因物质为基础，研究而成的基因治疗剂等。 2 药理学特性：药理活性高；治疗的针对性强，治疗的生理、生化机制合理，疗效可靠；毒副作用少，营养价值高；生理 副作用常有发生； 理化性质：生物材料中的有效物质含量低，杂志种类多且含量相对较高；生物活性物质组成结构复杂、稳定性差；生物 材料易染菌、腐败；对制剂的均一性、安全性和有效性有很高要求； 3 DNA 细胞因子干扰素(IFN)类药物 细胞因子白介素类和肿瘤坏死因子 造血功能药物：促红细胞生成素 EPO 生长因子类药物：神经生长因子 NGF 重组蛋白和多肽类激素：重组人生长激素 rhGH 心血管病治疗剂与酶制剂 重组疫苗与治疗性抗体 4、 术语： 药物：用于预防、治疗或诊断疾病或调节机体生理功能、促进机体康复保健的物质，有 4 大类：预防药、治疗药、诊断 药和康复保健药。 药品：直接用于临床的药物产品，是特殊商品。药品应规定有适应症、用法与用量和疗程，说明毒副反应。还要有使用 有效期，过期药品不准使用。 生物药物：是以生物体、生物组织或其成份为原料（包括组织、细胞、细胞器、细胞成分、代谢、排泄物）综合应用生 物学、物理化学与现代药学的原理与方法加工制成的药物。 DNA 重组药物：是应用重组 DNA 技术制造的重组多肽、蛋白质药物和疫苗、单克隆抗体等； 基因药物：以遗传物质 DNA、RNA 为物质基础制造的药物一般把采用 DNA 重组技术或单克隆抗体技术或其他生物技术 制造的蛋白质、抗体或核酸类药物统称为生物技术药物(biotech drug)，在我国又统称为生物制品。 反义药物：以人工合成的 10几十个反义寡核苷酸序列与模板 DNA 或 mRNA 互补形成稳定的双链结构，抑制靶基因的 转录和 mRNA的翻译，从而起到抗肿瘤和抗病毒作用。 核酸疫苗：指使用能够表达抗原的基因本身即核酸制成的疫苗。 RNAi：RNA 干涉，是指在生物体细胞内，dsRNA(双链 RNA)引起同源 mRNA 的特异性降解，因而抑制相应基因表达的 过程。 1 P44 浓缩方法：盐析；有机溶剂沉淀；高分子脱水；超滤；真空或薄膜浓缩 干燥：低温真空干燥；喷雾干燥；冷冻干燥 羊羊制造 2 2 P49 根据分子形状与分子大小：差速离心、膜分离 根据电荷差异：离子交换法、电泳法 根据分子极性与溶解度大小：溶剂提取法、盐析法、等电点沉淀法 根据吸附特性：吸附层析法 根据生物配基特性：亲和层析法 3 P55 菌种保藏方法：斜面低温保存；液体石蜡封藏法；甘油冷冻法；冷冻干燥法；液氮保藏法 菌种退化：菌株的生活力、产孢子能力的衰退和特殊产物产量的下降统称为退化 鉴别：单位容积中发酵液的活性物质含量；琼脂平皿上的单菌落形态不同培养时期菌体细胞的形态和主要遗传特 征发酵过程的 pH 变动情况发酵液的气味、色泽 4 DNA P72 基本原理：基因工程技术和蛋白质工程技术 获得目的基因的方法： 鸟枪克隆法 提取细胞总 DNA，经过酶切、克隆至特定载体，再转化至特定宿主细胞，构建成具有一定大小的基因文库， 以同源基因为探针，进行杂交获得的目的基因 人工合成目的基因： 酶促方法 获得编码基因的 mRNA， 在逆转录酶的作用下合成互补 DNA， 在 DNA 聚合酶 I的作用下， 加工成为双链 DNA 分子。 化学合成法 已知基因的核苷酸序列 聚合酶链反应 PCR扩增获得目的基因 5 P79 常见的基因载体： E.coli 质粒（非表达型 pBR322、表达型 pUC、实用型 pBV220、PET 系统、 噬菌体 DNA 作为载体、非表达型 gt10、 表达型 gt11） ； 芽孢杆菌（pUB110、 pE194、pC194） ； 链霉菌（pIJ101、pSG5） 基因重组体的构建： 黏端连接：目的基因和载体之间具有彼此互补的黏性末端，在较低的温度可以形成氢键，在通过 T4DNA 连接酶便可以连 接成完整的重组 DNA 分子。 平端连接：DNA的平齐末端之间进行连接，与黏性末端相比，连接效率较低 TA克隆：一种直接将 PCR基因产物进行快速克隆的方法 6 DNA （1）原核表达系统：E.coli；芽孢杆菌 Bacillus；链霉菌 Streptomyces 优点：易大量生产，成本低，周期短 缺点：多为胞内表达、提取困难，易生成包含体、含起始密码 Met(AUG)，有内毒素毒性 （2）真核表达系统：酵母表达；动物细胞 优点：易培养无毒性，易高密度发酵（100g/L） ，高表达，成本低，产物可糖基化，有分泌表达。 7 P109 目的： 建立稳定工艺、大批量制备足量合格产品，供应临床前与临床研究； 羊羊制造 3 研究工艺参数制定工艺规程和检定规程，为正式生产提供工艺参数，保证能在以后生产中应用。 8 P102 吸附法：分为物理吸附法和离子交换吸附法 包埋法：将酶或细胞定位于凝胶高聚物网络，如卡拉胶，海藻胶，聚丙烯酰胺 共价键结合法：酶分子与载体分子，通过化学偶联使酶与载体共价结合。 交联法：用双功能试剂将酶与载体交联固定化 9、 术语： 诱变育种-有意识地将生物体暴露于物理的、化学的或生物的一种或多种诱变因子，促使生物体发生突变，进而从突变体 中筛选具有优良性状的突变株的过程 蛋白质工程-在基因水平上设计表达新的功能蛋白 转基因动物-将外源基因导入哺乳动物的受精卵或胚胎中，使导入基因与受精卵染色体整合，并将外源基因稳定性地传给 子代，使子代表现外源基因的性状 蛋白质组学-研究细胞、组织或个体全部蛋白质的表达状态与功能状态是后基因组时代的重要研究方向 酶工程-酶学与工程学互相渗透结合，发展形成的生物技术，它是从应用目的出发，研究酶和应用酶的特异催化功能，并 通过工程化过程将相应原料转化成所需产物的技术 immobilized enzyme-固定化酶，借助于物理和化学的方法把酶束缚在一定空间内并具有催化活性的酶制剂。 1 P117 加入凝聚剂：某些无机盐可使细胞、细胞碎片和蛋白质等胶体颗粒发生凝聚作用而被去除。在发酵液中加入具有相反电 性的电解质可以中和胶粒电性，降低双电层排斥力。 离子的水化作用，破坏胶粒的水化层。影响凝聚作用的主要因 素有无机盐的种类、化合价以及无机盐的用量等。常用的凝聚剂有：Al2(SO4)318H2O、AlCl36H2O、FeCl3、ZnSO4、 MgCO3 等。 加入絮凝剂：絮凝剂是天然的或人工合成的有机高分子化合物，如壳聚糖、海藻酸钠、明胶及酰胺类衍生物、聚苯乙烯 类衍生物和聚丙烯酸类等。当往胶体悬浮液中加入絮凝剂时，胶粒可强烈的吸附在絮凝剂表面的功能团上，而且一个高 分子聚合物的许多链节分别吸附在不同颗粒的表面上，产生架桥联接，形成粗大的絮凝团沉淀出来，有助于过滤 变性沉淀：天然蛋白质受到某些物理、化学因素影响，生物活性丧失，溶解度降低，沉淀析出 吸附：加入吸附剂，如活性炭；加入反应剂，例如四环素发酵液中加入黄血盐和硫酸锌，生成亚铁氰化锌钾的胶状沉淀， 能将杂蛋白质和菌体等黏附在其中而除去。 等电点沉淀 加各种沉淀剂沉淀 2 P119 离子交换法：阳离子交换树脂可除去某些例子。 沉淀法：Ca2+ 草酸 Mg2+ 磷酸盐,三聚磷酸钠 Fe3+ 黄血盐 3 P118 絮凝剂的分子量：分子量越大，链越长，架桥联接作用越明显。但过大的分子量使溶解度降低 絮凝剂的用量：浓度较低时，加大浓度可提高絮凝效果；但过量会引起吸附饱和 溶液 pH 值 搅拌速度和时间：刚加入絮凝剂搅拌速度较快能使絮凝剂迅速分散，发挥絮凝作用，不易再搅拌 羊羊制造 4 4 P120 3-1 5 P122 超声波对细胞的破碎作用与液体中空穴的形成有关。 当超声波在液体中传递时液体中的某一小区域交替重复的产生巨大 的压力和拉力。由于拉力的作用，出现细小的空穴。这种空穴跑在超声波的继续作用下，又迅速闭合，产生一个极为强烈的 冲击波压力，由它引起的粘滞性漩涡在悬浮细胞上造成了剪切应力，促使其内部液体发生流动，而使细胞破碎 6、 术语： 凝聚作用：指在某些电解质作用下，使胶体粒子的扩散双电层的排斥电位降低，破坏了胶体系统的分散状态，而使胶体 粒子聚集的过程。 絮凝作用：当往胶体悬浮液中加入絮凝剂时，胶粒可强烈的吸附在絮凝剂表面的功能团上，而且一个高分子聚合物的许 多链节分别吸附在不同颗粒的表面上，产生架桥联接，形成粗大的絮凝团沉淀出来，有助于过滤，这一过程称为絮凝作 用。 渗透压冲击法：把细胞放在高渗溶液中，细胞发生收缩，然后将介质快速稀释或将细胞转入水或缓冲液中，细胞快速膨 胀，使产物释放至溶液中 错流过滤：滤液给过滤介质表面一个平行的大流量冲刷，则过滤截止表面积累的滤饼就会减少到可以忽略的程度，而通 过过滤介质的流速却比较小，这种过滤方式为错流过滤。 1 P134 抗生素在不同的 pH 条件下，可以有不同的化学状态，其分配系数亦有差别，若适度改变 pH，可将抗生素自水相转入有机 相，或从有机相再转入水相，这样反复萃取，可以达到浓缩和提纯的目的 2 P136 单级萃取 多级错流萃取：萃取次数愈多，则萃取愈完全 多级逆流萃取：收率不仅取决于分配系数的大小和萃余液中残留量，还取决于提取过程中产物的局部破坏，以及蛋白质 造成提取过程乳化所带来的损失等。 羊羊制造 5 3 P138 界面膜形成：表面活性剂分子积聚在界面，形成排列紧密的吸附层，并在分散相液滴周围形成保护膜 界面电荷的影响：乳状液液珠带点，当液珠相互接近时就产生排斥力，阻止了液滴聚结 介质黏度：乳化剂增加乳状液的黏度，增加保护膜的机械强度 4 P139 加入表面活性剂：改变表面张力 离心：促使乳状液液滴碰撞聚集 加电解质：中和乳浊液分散相所带的电荷，促使其聚凝沉淀 加热：增加液珠的布朗运动，使絮凝作用加快 吸附法破乳：乳状液经过一个多孔性介质时，由于该介质对油和水的吸附能力的差异，可以引起破乳 高压电破乳 稀释法，加入连续相，可使乳化剂浓度降低而减轻乳化 5 P138 相体积的影响：定分散相为大小均匀的圆球，按紧密地堆积，圆球体积占总体积的 74%。如水的体积占总体积小于 26% 时，只能形成 WO 型乳状液；大于 74%时，只能形成 OW 型乳状液。 乳化剂分子空间构型的影响：积小的一头指向分散相，截面积大的一头指向分散介质，所以一价金属皂形成 OW 型乳 状液，而二价金属皂形成 WO 型乳状液。 界面张力的影响：化剂聚集于界面形成薄膜，若两相界面张力不等，则使膜弯曲，其凹面一侧为界面张力较高的相，高 界面张力这侧的液体易形成内相。 容器壁性质的影响：水性强的容器易得 OW 型乳状液，亲油性强的容器易形成 WO 型乳状液。 6 P150 成相高聚物的分子量：对于给定的相系统，如果一种高聚物被低分子量的同种高聚物所代替，被萃取的大分子物质，如 蛋白质、核酸、细胞粒子等，将有利于在低分子量高聚物一侧分配。 成相聚合物浓度界面张力：相系统组成位于临界点附近，则蛋白质等大分子的分配系数接近于 1。高聚物浓度增加， 系统组成偏离临界点，蛋白质的分配系数也偏离 1，即 K1 或 K1 电化学分配盐类的影响：各种盐的分配系数存在着微小的差异，产生了相间电位。由于蛋白质等大分子在水溶液中 常带有电荷，相间电位造成的静电力能影响所有带电大分子和带电细胞粒子在两相中的分配。 疏水效应：选择适当的盐组成，相系统的电位差可以消失。排除了电化学效应后，决定分配系数的其它因素，如粒子的 表面疏水性能即可占主要地位。成相高聚物的末端偶联上疏水性基团后，疏水效应会更加明显，此时，如果被分配的蛋 白质具有疏水性的表面，则它的分配系数会发生改变。 温度及其它因素：温度的影响是间接的，它主要影响相的高聚物组成，只有当相系统组成位于临界点附近时，温度对分 配系数才具有较明显的作用。 pH 对酶的分配系数也有很大关系，特别是在系统中含有磷酸盐时，如图 4-18 所示。由于 pH 的变化会影响磷酸盐是一氢化物还是二氢化物磷酸盐的存在，而一氢化物磷酸盐对界面电位有明显的影响。 羊羊制造 6 7 P160 压力的影响：一是高压区的全萃取，高压时,SCF 的溶解能力强,可最大限度地溶解大部分组分；二是低压临界区的脱臭， 在临界点附近,仅能提取易溶解的组分,或除去有害成分;三是中压区的选择萃取，在高低压区之间,可根据物料萃取的要求, 选择适宜压力进行有效萃取。 温度的影响：一个是温度对流体密度的影响，随温度升高，CO2 流体密度降低，导致其溶剂化效应下降，对物质的溶解 度也下降；另一个是温度对物质蒸气压的影响，随温度升高，物质的蒸气压增大，使物质在 CO2 流体中的溶解度增大。 助溶剂：从经验上看，加入极性夹带剂对提高极性成分的溶解度有帮助，对非极性溶质作用不大；相反，非极性夹带剂 对极性和非极性溶质都有增加溶解度的效能。 物料性质的影响 8 双水相萃取：利用不同的高分子溶液相互混合可产生两相或多相系统，静置平衡后，分成互不相溶的两个水相，利用物 质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法 双节线：将一定量的高聚物 P 浓溶液置于试管内，然后用已知浓度的高聚物溶液 Q 来滴定。随着高聚物 Q 的加入，试管 内溶液由均相突然变浑浊，记录 Q 的加量。然后再在试管内加入 1ml 水，溶液由澄清，继续滴加高聚物 Q，溶液又变浑 浊，计算此时系统的总组成。以此类推，由实验测定一系列双节线上的系统组成点，以高聚物 P 浓度对高聚物 Q 浓度作 图，既可得到双节线。 多级错流萃取：料液经萃取后的萃余液再用新鲜萃取剂进行萃取饿方法称多级错流萃取 多级逆流萃取：在第一级中加入料液，萃余液顺序作为后一级的料液，而在最后一级加入萃取剂，萃取液顺序作为前一 级的萃取剂，料液移动方向和萃取剂移动方向相反，故称为逆流萃取。 反胶束萃取 P156 超临界流体萃取：利用处于临界压力和临界温度以上的一些溶剂流体所具有特异增加物质溶解能力来进行分离纯化的技 术。 1 P166 盐析沉淀：向蛋白质溶液中逐渐加入中性盐，在高盐浓度时，蛋白质溶解度随之减小，发生演戏作用。 原理： 一是盐离子与蛋白质表面具有反电性的离子基团结合， 形成离子对， 蛋白质电性被中和， 排斥作用减弱而聚集； 二 是中性盐的亲水作用大于蛋白质，使蛋白质脱去水化膜。暴露疏水区，使之沉淀。 2 P168 无机盐的种类：半径小的高价离子在盐析时的作用较强，阴离子的盐析效果比阳离子好，尤其以高价阴离子更为明显。 溶质（蛋白质等）种类的影响 蛋白质浓度的影响：蛋白质浓度提高，盐用量减少。 温度：在无盐或稀盐溶液中，大多数蛋白质溶解度是随温度升高而增大的，但在高盐溶液中常相反。 pH：当溶液的 pH 在蛋白质等电点附近时， 值最小。 3 P174 有机溶剂种类及用量-常用的溶剂有乙醇、丙酮、甲醇等。 pH：许多蛋白质在等电点附近时溶解度最低，溶液 pH 应在等电点附近，还须考虑蛋白质的稳定性。 温度（低温沉淀） ：有机溶剂存在下，大多数蛋白质的溶解度随温度降低而显著地减小。 无机盐的含量：低盐有利于沉淀，还有保护蛋白质，防止变性。高盐增大蛋白质在有机溶剂水溶液中的溶解度，沉淀 物中可能夹带盐。 某些金属离子的助沉淀作用-多价阳离子，如 Ca2+、Zn2+能与蛋白质结合形成复合物，使蛋白质溶解度降低。 样品浓度-浓度小时，增加溶剂投入量和损耗。浓度大时，增加共沉作用，降低分辨率。 羊羊制造 7 4 P180 蒸发法 温度诱导法 热盒技术 盐析结晶法 透析结晶法 有机溶剂结晶法 等电点法 微量扩散法 化学反应结晶法：调节溶液的 pH 或向溶液中加入反应剂，生成新物质，结晶析出。 共沸蒸馏结晶 5 P183 影晶体大小的主要因素有过饱和度、温度、搅拌速度、晶种等。 过饱和度：增加过饱和度能使成核速度和晶体生长速度加快，且前者较快，而形成的晶体较细小 温度：冷却速度，能达到较高的过饱和度，所得晶体较小 搅拌速度：搅拌能促进成核和加快扩散，提高晶核长大的速度 晶种：加入晶种能诱导结晶，而且还能控制晶体的形状、大小和均匀度。 6 P176 对于两性物质，等电点时净电荷为零，使稳定的双电层及水化膜变弱或破坏，分子间排斥电位降低，吸引力增大，相互 聚集，产生沉淀。等电点沉淀法操作简单，试剂消耗量小，引入杂志较少。主要适用于水化程度不大，在等电点时溶解度很 低的物质。如胰岛素纯化，调 pH8.0 去除碱性杂蛋白，调 pH3.0 去除酸性杂蛋白。 7 Ks 盐析：在一定的 pH 和温度下改变离子强度（盐浓度）进行盐析，称作 Ks 盐析法。 盐析：在一定离子强度下仅改变 pH 和温度进行盐析，称作 盐析法。 盐析分布曲线：蛋白质沉淀速度可用-dS/dP 对盐饱和度(P)作图，从起始沉淀到沉淀结束，形成的具有尖峰的曲线。 透析结晶法 P180- 1 P187 项目 物理吸附 化学吸附 作用力 吸附热 选择性 吸附速度 吸附分子层 范德华力 较小,接近液化热 几乎没有 较快,需要的活化能很小 单分子或多分子层 化学键力 较大,接近反应热 有选择性 慢,需要一定的活化能 单分子 2 极性吸附剂易吸附极性物质，非极性吸附剂易吸附非极性物质； 极性吸附剂适宜从非极性溶剂中吸附极性物质； 非极性吸附剂适宜从极性溶剂中吸附非极性物质。 3 P188 一般吸附物浓度大时，吸附量也大。由于杂志的存在，浓度升高后吸附的杂质量也上升，选择性下降。对蛋白质或酶进 羊羊制造 8 行分离时要求浓度 1%以下。 吸附剂用量增大，吸附物的平衡浓度要变小，每克吸附剂所吸附物质的量也要变少，但总量会多些，同时吸附剂用量过 多，会导致成本升高、选择性下降，因此要综合考虑各方面因素。 4 P189 活性炭：粉末状，颗粒状，锦纶活性炭，是吸附能力很强的非极性吸附剂。溶剂中吸附力：水乙醇甲醇酯丙酮氯 仿。主要用于去色素、热原，用量 0.021% 硅胶：硅胶表面的硅羟基能吸附多量的水，称自由水，活性随自由水含量增加而下降。能吸附非极性化合物和极性化合 物 5 选择性好、解吸容易、理化性质稳定、机械强度好、可反复使用等优点。 其孔隙大小、骨架结构和极性，可按照需要，根据不同的原料和合成条件而改变，因此可适用于吸附各种有机化合物。 适合弱电解质及非离子型化合物分离 6 正吸附：吸附提取液中的有效成分 负吸附：用于去除提取吸附液中的杂质的吸附方法 大网格高聚物吸附剂：在树脂聚合时加入惰性的致孔剂，待网格骨架固化和链结构单元形成后，用溶剂萃取或蒸馏水洗 将致孔剂去掉，形成不受外界环境条件影响的孔隙，其孔径远大于 24nm，可达 100nm，故称“大孔”。 1 Ve=Vo+KdVi P198 原理：当具有一定分子量分布的高聚物溶液从柱中通过时，较小的分子在柱中停留时间比大分子停留的时间要长，样品 各组分即按分子大小顺序而分开，最先淋出的是最大的分子。 Ve=Vo+KdVi Ve淋出体积，Vo粒间体积，Kd“排阻系数”或分配系数，反映了物质分子进入凝胶颗粒的程度，Vi孔体积 2 P203 葡聚糖凝胶 修饰葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖类凝胶 多孔玻璃微球 疏水性凝胶（hydrophobic gels）:分离不溶水的有机物质。 3 P212 凝胶的选择凝胶性质（分离分子量范围、理化稳定性、强度、非特异吸附剂）和分离目的 (1).将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类分离或组分离。使大分子的分配系数 Kd=0；小分子的 Kd=1。 (2).将分子量相差不大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离。使各种物质的 Kd 值尽可 能相差大。不使分子量分布在凝胶分离范围的一侧。分子量大于渗入限的 3 倍，并小于排阻限的 1/3。 凝胶粒度的选择：细粒凝胶柱流速低，洗脱峰窄，分辨率高，用于精制分离或分析。粗粒凝胶柱流速高，洗脱峰平坦， 分辨率低，用于粗制分离，脱盐。 4 P214 层析柱的选择： 羊羊制造 9 层析柱长度与直径的比值称作“柱比” 。 对于类分离，柱床体积一般为样品溶液体积的 5 倍，柱比 5 到 10。 对于分级分离，则要求柱床体积大于样品体积 25 倍以上，甚至多达 100 倍。柱比在 25 至 100 之间。 层析柱的装填 凝胶柱底部支持物，有棉花、玻璃纤维、玻璃珠、垂熔玻璃等。 空柱中应留约 1/5 的水或溶剂。 不断搅拌下使胶粒均匀沉降，使不发生凝胶分层和胶面倾斜。 5 P224 分子扩散-小而均匀的填料；适当的溶剂；提高流速 涡流扩散-与填料颗粒的形状，尤其是颗粒尺寸有关。 流动相中传质阻力-流动相在柱中的流速是不均匀的。溶质分子有流速的梯度而导致溶质分子的浓度梯度，径向扩散。 固定相中传质阻力-分子从固定相中脱离出来到流动相中去， 而另一些分子则从流动相进入固定相中。 结果使溶质层变宽。 6 P228 在凝胶的分离范围内，不同分子量的物质其洗脱体积 Ve 及分配系数 Kd 值随分子量增加而下降。对于一个特定凝胶柱， 待测定物质的洗脱体积与分子量的关系符合公式 Ve=-KlogM+C （1）求解法:（两个已知分子量的蛋白质过柱） （2）标准曲线法:（先以 3 个以上已知分子量的标准蛋白过柱 ） 7 柱比-层析柱长度与直径的比值称作“柱比” 。 操作压-层析柱由于进出口之间液位压力差形成的对凝胶颗粒的压力称作“操作压” 。 内水体积-填料的孔体积 外水体积-填料颗粒之间的体积 类分离-将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类分离或组分离。 分级分离-将分子量相差不大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离。 排阻系数 全渗入-当 Kd=1 时，洗脱体积 Ve=V0+Vi，为全渗入。 全排阻-当 Kd=0 时，洗脱体积 Ve=V0，为全排阻。 分离限 分辨率 1 P233 调节洗脱液的 pH 值，使目的物粒子在此 pH 下失去电荷，甚至带相反电荷，从而丧失与原理子交换树脂的结合力而被洗 脱下来。 用高浓度的同性离子将目的物离子取代下来。 2 P235 强酸类 1100 号；弱酸类 101200；强碱类 201300；弱碱类 301400；中强酸类 401500 交联度：是合成载体骨架时交联剂重量的百分数，用“”将树脂编号与交联度分开。弱酸 101 4 其交联度为 4。 国内常用树脂命名：724 弱酸阳离子交换树脂；732 强酸阳离子交换树脂；717 强碱阴离子交换树脂 树脂骨架：苯乙烯型离子交换树脂、丙烯酸型离子交换树脂 羊羊制造 10 3 P244 离子交换树脂具有的功能基团性质和数目，数目是其交换容量的基础 树脂的交联度。它对树脂的相对密度、强度、树脂强度、交换选择性、动力学性质都有重要影响。 树脂骨架和平衡离子 4 P250 5 P254 大孔型离子交换树脂的特征：载体骨架交联度高；孔径大；表面积大，表面吸附强，对大分子物质的交换容量大；孔隙 率大。 均孔树脂：交联度均匀，孔径大小一致，交换容量都较高，膨胀度、机械强度好。 6 P257 特点： 开放的长链骨架，亲水性强，表面积大，易吸附大分子。 交换基团稀疏，对大分子的实际交换容量大。 吸附力弱，交换和洗脱条件缓和，不宜变性。 分辨率高。 洗脱要缓和。升高环境的 pH、降低 pH 或是增加离子强度都能将被吸附物质洗脱下来。 7 P259 与离子交换树脂的选择相似，一般在介质中带正点的物质用阳离子交换剂；大夫点的物质用阴离子交换剂。 8 自动形成 pH 梯度：在聚焦层析中，当洗脱液流进多缓冲交换剂时，由于交换剂带有缓冲能力的电荷基团，故 PH 梯度溶 液可以自动形成。 蛋白质的色谱行为： 当柱中 PH 低于蛋白质的 PI时，蛋白质带正电荷，不与阴离于交换剂结合,随洗脱液向下移动 。 当蛋白质移动至环境 PH 高于其 PI时，蛋白质由带正电荷变为带负电荷，并与阴离子交换剂结合。 由于洗脱剂的通过，蛋白质周围的环境 PH 再次低于 PI时，它又带正电荷，并从交换剂解吸下来而下降 。移至 pH 大于 PI时又重新结合，直至蛋白质从柱下流出。 不同蛋白质具有不同的等电点，在被离子交换剂结合以前，移动距离是不同的，洗脱出来的先后次序是按等电点排列的。 聚焦效应： 当一种蛋白质在柱上随洗脱液下移至等电点处时，移动速度明显减慢。 此时加上相同的第二个样品，它将以洗脱液移动的速度下降，直至追到正在慢移的第一个样品（聚焦） 。 如果加入的第二个样品的等电点比第一个样品高，它可以越过第一个样品区先被洗脱出来。 9 离子交换树脂：苯乙烯型离子交换树脂、丙烯酸型离子交换树脂 离子交换纤维素： 羧甲基纤维素（CM-C） ：弱酸性阳离子交换纤维素，pK=3.6 。 二乙基氨基乙基纤维素（DEAE-C） ：强碱型阴离子交换纤维素，pK=9.1。 10 CM-C：羧甲基纤维素 DEAE-C：二乙基氨基乙基纤维素 羊羊制造 11 PBE94：是以交联琼脂糖 6B（Sepharose 6B）为载体，并在糖基上通过醚键偶合上配基制成的多缓冲交换剂，是阴离子交 换剂。 尼柯尔斯方程：用 m1、m2 及 C1、C2 分别代表树脂上和溶液中的两种离子的浓度。 交换带：交换离子 A1 由于被树脂吸附，其浓度从起始浓度 Co 逐渐下降到 0 的树脂层。 交换容量 P243 树脂再生：使用过的树脂重新获得使用性能的处理过程。 偶极离子排斥：被吸附氨基酸的羧基所带的负电荷与树脂磺酸基之负电荷产生排斥力，这就是偶极离子的排斥力。 蛇笼树脂：由丙烯酸或甲基丙烯酸在季胺型阴离子交换树脂中聚合而成的一类树脂 1 P273 亲和层析是利用生物大分子物质具有与某些相应的分子专一性可逆结合的特性而建立的层析技术。 适用于从成份复杂且杂 质含量远大于目标物的混合物中提纯目标物。 原理： 配基固定化：配基与载体偶联，结合成具有特异亲和性的分离介质。 吸附样品：亲和层析介质选择性吸附生物活性物质. 样品解吸：选择适宜的条件使被吸附物活性物质解吸。 特点： 经过一次处理可得到高纯度活性物质 ； 特异性强、分离效果好、分离条件温和； 亲和吸附剂通用性较差，专用的吸附剂。 2 P275 亲和层析配基的选用主要取决于分离对象。 配基与配体有足够大的亲和力 （亲和势） ，KL 在 10-410-8 之间。 配基与配体的结合应是专一的 。 配基应具有化学活性 。 3 P277 小分子物质作为配基，载体和配基间插入一个“手臂”以消除空间障碍。手臂的长度是有限的，不可太长也不可太短，太长 往往会使非特异性吸附增加，太短不能起消除空间障碍的作用。 4 P285 影响因素 KL 配基浓度对亲和力的影响 空间障碍的影响 配基与载体的结合位点的影响 载体孔径的影响 微环境的影响 方法 为将亲和配体与其它物质分开，需要阻留值10。 配基浓度与亲和对解离常数相关。 对于低亲和力系统，配基浓度。 5 P291 离子效应：配基与载体-间隔臂的不完全结合，将无关离子基团引入吸附剂。具有离子基团的亲和吸附剂会影响蛋白质的 羊羊制造 12 洗脱行为。 疏水基团：吸附剂疏水性基团与蛋白质结构中的疏水区相互吸引，形成非专一性吸附 复合亲和力：离子效应作用，又有疏水作用。配体与配基有较强生物特异性。用高浓度的盐和有机溶剂，以提高选择性。 6 P293 非专一性洗脱：通过改变洗脱剂的 pH 以影响电性基团的解离程度而洗脱 特殊洗脱：用特殊的化学方法裂解配基与载体的连接键 专一性洗脱：竞争性效应、非竞争性效应、反竞争性效应 7 利用在物理场改变时溶解度下降、发生可逆性沉淀的水溶性聚合物为载体固定亲和配基。亲和介质结合目标分子后，通 过改变物理场使介质与目标分子共同沉淀的方法称为二次作用亲和沉淀。 8 P297 亲和膜利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，是固定床亲和层析的变型。 优点： 传质阻力小，达到吸附平衡的时间短； 配基利用率高，配基用量低； 压降小，流速快； 设备体积小。 9 亲和力： 亲和吸附剂： 配基： 阻留值： 正洗脱：竞争性效应，即 ESI不如 EI稳定，增加洗脱剂中 I，会使 E 洗脱下来 负洗脱：反竞争性效应，即 ESI比 EI 稳定，I使 E 与 S 结合更紧密 金属螯合亲和层析：将环氧活化型 Sepharose 6B 与金属螯合剂偶联，再用金属离子溶液处理制成金属螯合亲和层析柱。 有机染料亲和层析：染料共价偶联到琼脂糖载体上，能制得亲和层析柱 亲和错流过滤：亲和层析与超滤技术结合，高分子底物经专一可逆的亲和反应后，用膜进行错流过滤，兼有亲和层析与 膜过滤的优点。 亲和萃取： 利用偶联亲和配基的PEG为成相聚合物进行的双水相萃取， 在亲和配基的亲和结合作用下促进目标产物在PEG 相（上相）的分配，提高目标产物的分配系数和选择性。 亲和反胶团萃取：指在反胶团相中除通常的表面活性剂以外，添加另一种亲水头部为亲和配基的助表面活性剂 1 相对离心力（relative centrifugal force，RCF）由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，在相同 转速下离心力会变化，RCF 就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。 grN rN mg N 101.118 9803600 4 3600 rm4 25- 22 22 x RCF 式中 r 为离心转子的半径距离，以 cm 为单位；g 为地球重力加速度（980cm/sec2） ；N 为转子每分钟的转数（rpm） 。 羊羊制造 13 2 P316 料液浓度变化不影响分离效率，适应范围广 对固体颗粒大小适应范围广 占地面积小，处理量大 可用于易燃易爆及密闭的含有毒物的操作场合 对难于沉降的固体颗粒，可通过调节转鼓与螺旋的转速差来提高分离效率 可加入凝聚剂，加快固体沉降速度 3 4 P318 角度转子 水平转子 区带转子 垂直管转子 连续离心转子 细胞洗脱转子 5 P320 差分离心法亦称为“差速离心法”，是依据不同大小和密度的颗粒在离心力场中沉降速度的不同进行离心分离的一项技 术。 过程是将样品溶液在一定离心力场中离心一定时间使颗粒大组分沉降于管底，上层液再用加大的离心力场离心一定时 间，又可获得中等大小的组分。如此依次提高离心力，逐级分离出所需组分，故称其为差分离心法。 用途：差速离心的分辨率不高，沉降系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于颗粒或密度差别较大的组分 的分离，或其他分离手段之前的粗制品提取 6 P320 速度区带离心法 又称速率区带离心法或分级区带离心法。 离心操作时将样品液置于连续或不连续， 线性或非线性密度梯度液上 （如蔗糖、 甘油、KBr、CsCl 等） ，控制离心时间，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，从而达到彼 此分离的目的。 特点： （1）样品加于梯度介质的顶部、离心时间须严格控制。 （2）介质的密度亦须严格掌握：梯度最大值组分最小密度。 （3）样品的密度梯度密度最小值。 （4）分离依据是各组分之沉降系数差。 （5）分辨率受组分沉降系数，离心时间，颗粒扩散系数，介质粘度及梯度范围和形状的影响。 等密度离心法 离心力作用下，不同密度的多组分颗粒在梯度介质中“向上”或“向下”移动，当移动至其密度与介质密度相等的位置便不 再移动，形成静止区带，即达到离心平衡，各组分按密度不同处于区带的不同位置。该离心方法称等密度离心法。 特点： （1）加样位置不拘。 （2）离心平衡后，区带的位置、形状、不受离心时间影响。 羊羊制造 14 （3）梯度的密度范围应包括样品中所有组分颗粒之密度。 （4）分离依据是颗粒组分间密度的差异，与颗粒大小，形状无关。 （5）离心力大小，组分颗粒的大小和形状，介质密度梯度的斜率和形状，粘度影响离心时间和分辨率。 7 P323 蔗糖：水溶性大，性质稳定，渗透压较高，且由于价格低容易制备，是现在实验室里常用于细胞器、病毒、RNA 分离的 梯度材料，但由于有较大的渗透压，不宜用于细胞的分离。 聚蔗糖：商品名 Ficoll，常采用 Ficoll-400 也就是相对分子重量为 400000，Ficoll 渗透压低，但它的粘度却特别高，为此 常与泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞等。 氯化铯： 是一种离子性介质、 水溶性大。 由于它是重金属盐类， 在离心时形成的梯度有较好的分辨率， 被广泛地用于 DNA、 质粒、病毒和脂蛋白的分离，但价格较贵。 卤化盐类：KBr 和 NaCl 可用于脂蛋白分离，KI 和 NaI 可用于 RNA 分离其高于铯盐。NaCl 梯度也可用于分离脂蛋白， NaI梯度可分离天然或变性的 DNA。 Percoll：是商品名，它是一种 SiO2 胶体外面包了一层聚乙烯吡咯酮（PVP） ，渗透压低，它对生物材料的影响小，而且颗 粒稳定，在冷却和冻融情况下还是稳定的，其粘度高，且在酸性 pH 和高离子强度下不稳定。它可用于细胞、细胞器和病 毒的分离。 8 P324 手工制备法 梯度混合仪制备法 离心形成法 反复冻融法 9 P326 取代法、穿刺法、切割法、虹吸法 10、 术语： -在一定角度速度下作圆周运动的任何物体都受到的向外的力 -于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，在相同转速下离心力会变化，RCF 就是实际离 心场转化为重力加速度的倍数。 -在离心力作用下，物质粒子于单位时间内沿离心力方向移动的距离。 -在单位离心力场中，颗粒的沉降速度谓之“沉降系数” 1 P338 在溶剂中能形成分子筛状多孔薄膜，只允许小分子溶质通过，而阻止大分子（如蛋白质）通过； 化学惰性；在水、盐溶液、稀酸或稀碱溶液中稳定； 良好的物理性能：有一定的机械强度和良好的再生性能 2 高效：由于膜具有选择性，它能有选择性地透过某些物质，而阻挡另一些物质的透过。选择合适的膜，可以有效地进行 物质的分离，提纯和浓缩。 节能：多数膜分离过程在常温下操作，被分离物质不发生相变, 是一种低能耗，低成本的单元操作。 过程简单、容易操作和控制。 不污染环境。 羊羊制造 15 3 P339 旋转透析器 平面透析器 连续透析器 浅流透析器 4 透析前，对装有试液的透析袋检查是否有泄漏； 透析袋装一半左右，防止膜外溶剂因浓度差渗入将袋涨裂或过度膨胀使膜孔径改变； 搅拌；定期或连续更换外部溶剂可提高透析效果。 5 P341 超过滤(简称超滤)是一项分子级膜分离手段， 以压力差为推动力将不同分子量的物质进行选择性分离。 一般用于液相分离， 也可用于气相分离。 优点： 大分子物质的脱盐和浓缩，以及大分子物质溶剂系统的交换平衡 小分子物质的纯化 大分子物质的分级分离 生化制剂或其他制剂的去热原处理 6 P346 外源压力迫使分子量较小的溶质通过薄膜，大分子被截留于膜表面，并逐渐形成浓度梯度，这就是浓差极化现象。 克服极化的措施：震动、搅拌、错流(cross flow) 、切流(tangent flow) 。 7 P346 无搅拌式装置 搅拌或震动式装置 小棒超滤器 中空纤维超滤 浅道系统超滤装置 8 P350 溶质分子性质：大小、形状和带电性质。 超滤膜的性质：孔径、结构、吸附性。 超滤装置和操作：膜或组合膜的构造、超滤器的结构以及操作压力、搅拌情况. 液体物料的温度、粘度、pH、离子强度。 9 P357 气泡压力法、细菌过滤法(最大孔径)、水流量法(平均孔径) 10 超滤：超过滤(简称超滤)是一项分子级膜分离手段，以压力差为推动力将不同分子量的物质进行选择性分离。一般用于液 相分离，也可用于气相分离。 分子量截留值：阻留率达 90%以上的最被截留物质的分子量。 各向异性膜：正反两面的结构不一致的膜。膜质分为“功能层”和 “支持层”， “功能层”具有一定孔径的多孔，决定膜的选 羊羊制造 16 择透过性质，厚度为 0.11 m； “支持层”孔隙大其支持作用，厚度约 0.1mm 。 浓差极化现象：外源压力迫使分子量较小的溶质通过薄膜，大分子被截留于膜表面，并逐渐形成浓度梯度，这就是浓差 极化现象。 水流量法：气体排除微孔滤膜孔隙中的液体并在膜表面形成气泡时，须克服液体的表面张力。孔径与气体压力的关系为： D=4Kcos/P 气泡压力法：先将滤膜以蒸馏水完全润湿，装于滤器中，下接抽气瓶。开动真空泵，使真空度稳定于 700mmHg 柱，然后 加入洁净蒸馏水 100ml，准确记录抽滤 100ml 水所需的时间。 孔隙率：微孔滤膜孔隙总体积与滤膜总体积之比为孔隙率。 1 HPLC 输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 收集系统 数据处理系统 2、 理论塔板数及分离度的计算公式。 理论塔板数：N = 16 (tR / wb)2 N = 5.54 (tR / w1/2)2 分离度： 3 HPLCHPLC 输液泵不同： 两种泵设计的特点及其性能 测器中的检测池不同 ：体积不同 色谱柱不同：规格主要是直径，粒径的大小 制备色谱一般配有电导检测器和 pH 值检测器分析型色谱没有： 制备色谱一般配备收集器分析型色谱没有 4 进样量:纯化过程中，目标物质的上样量。可以是体积也可以是质量。 速度:在除去蛋白酶的过程中此项非常关键。 产率:产品贵重时此项很重要。流动相的条件、环境会影响它。减少步鄹和保持一种对生物样品合适的环境条件。 回收率和纯度:在纯化的最后阶段，此项很关键，尤其是杂质的结构和目的物结构相似时。 5 疏水性 分子大小 等电点 结构特异性 6 What is the intended use of the product? 21 21 )(2 )( 2 1 1212 WW tt WW tt R rrrr 羊羊制造 17 What kind of starting material is available and how should it be handled? What are the purity issues in relation to the source material and intended use of the final product? What has to be removed? What must be removed completely? What will be the final scale of puridication? What are the economical constraints and what resources and equipment are available? 7 正相色谱 反相色谱：常加入 TFA 离子交换色谱：阴离子交换色谱（DEAE 二乙基氨基乙基，Q季胺盐）阳离子交换色谱（CM 羧甲基 S 磺酸基） 凝胶过滤色谱 疏水色谱：苯基，辛基等。 金属螯合色谱：镍、铜等 亲合色谱 8 待分离成分呈单一主峰 不易分开的两组分 目的组分含量少 9 塔板理论：阐明了色谱、蒸馏和萃取之间的相似性，将色谱柱设想成由许多液液萃取单元或理论塔板组成；相似于精馏 过程，色谱分离也是一个分配平衡过程 . 速率理论：研究各种动力学因素对峰展宽的影响。H= A+Cu 容量因子：溶质在固定相中的总摩尔数与流动相中总摩尔数之比。 选择因子：相邻两组份的分配系数或容量因子之比。 分离度：在色谱过程中表示两组分相互分离的程度 1 药理学特性： 药理活性高，针对性强 毒副作用少，营养价值高 生理副作用常有发生：免疫原反应、过敏反应 化学特性： 含量低、杂质多、工艺复杂、收率低、技术要求高； 结构复杂，生物活性受空间结构严格限制，稳定性差； 易染菌、腐败 天然生化药物是新型生物药物的先导物 生化药物的资源：植物、动物、微生物、海洋生物 2 蛋白水解法：胱氨酸、半胱氨酸 酶法：丙氨酸、天冬氨酸、色氨酸等 发酵法：苏氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等 羊羊制造 18 化学合成法：甘氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸等 3 4 氨基酸输液的组方原理和原则：一种优良的氨基酸输液注入人体后，各种氨基酸能得到最有效地利用，其组成平衡，使 临床症状得到改善，体重增加而无代谢并发症，血浆游离的氨基酸谱无显著变化，这就是氨基酸输液组方所要依据的原 理和原则。 常用输液类型：氨基酸营养输液、代血浆用输液、止血用氨基酸输液、婴幼儿用氨基酸输液、治疗用氨基酸输液 5 多肽类激素（垂体多肽激素、下丘脑激素、甲状腺激素、胰岛激素、胃肠道激素、胸腺激素） 、多肽类细胞生长调节因子、 含有多肽成分的其它生化药物 蛋白质激素（垂体蛋白质激素、促性腺激素、胰岛素、其他蛋白质激素） 、血浆蛋白质、蛋白质类细胞、生长调节因子、 粘蛋白、胶原蛋白、碱性蛋白质、蛋白酶抑制剂、凝集素 6 原料选择的注意事项：种属、发育生长阶段、原料环境、解剖部位、生物状态 分离纯化：溶解性、稳定性、合适的溶剂 7 8 DNA AB 链合成法：以人工合成的人胰岛素 A 链和 B 链基因分别表达 A 链和 B 链，然后再组合起来。 反转录酶法：通过胰岛素原的 cDNA 合成，表达产物是胰岛素原，经工具酶切开，除去 C-肽得人胰岛素。 9 10 11 核酸碱基及其衍生物;别嘌呤、醇巯嘌呤、磺硫嘌呤、氟尿嘧啶等 核苷及其衍生物、腺苷类、尿苷类、胞苷类、肌苷类、脱氧核苷类等 核苷酸及其衍生物：单核苷酸类、核苷二磷酸类、核苷三磷酸类、核苷酸类混合物 羊羊制造 19 多核苷酸：二核苷酸、多核苷酸类 12 13 消化酶类：胰酶、胰脂酶、胃蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等 消炎（抗炎） 、粘痰溶解酶类：胰蛋白酶、糜蛋白酶、 、SOD、菠萝蛋白酶、溶菌酶、玻璃酸酶、DNase 循环酶类：抗凝酶（链激酶、尿激酶、纤溶酶） 、止血酶（人凝血酶、蛇毒凝血酶、促凝血酶原激酶） 、血管活性酶（激 肽释放酶、弹性蛋白酶） 抗肿瘤酶：天冬酰胺酶、谷氨酰胺酶 其它生理活性酶：青霉素酶、尿酸酶、细胞色素 C 14 主要过程：原料选择、生物材料预处理、提取、浓缩、纯化、结晶 分离纯化过程中应注意：防止酶蛋白变性；防止复因子丢失；防止酶被蛋白水解酶降解 15 CuZn-SODMn-SOD 16 粘多糖基本上是由特殊的重复双糖单位构成，在此双糖单位中包括一个 N-乙酰氨基己糖 粘多糖的组成结构单位中有两种糖醛酸和两种氨基己糖 粘多糖中还有若干其它单糖作为附加成分，如半乳糖等 17 18 - 多糖的高级结构与生物活性的关系 多糖的分支度及其侧链与生物活性的关系 多糖的分子量与活性的关系 右旋糖苷：Mw10 万20 万。红细胞聚集。Mw2 万4 万红细胞解聚，治疗血栓。 多糖中的取代基与生物活性的关系 乙酰基：改变多糖的定向性和横次性 硫酸基：多糖本身结构(均一多糖)；分子量；硫酸基团的含量 19 生化药物：具体运用生物化学研究方法，从生物体中经提取、分离、纯化等手