酶的定向进化.ppt

酶的定向进化技术 一、定向进化的潜力 生物体系之所以能够相对独立地存在于自然界中 ，并维持其独立性和生命的延续性，都是因为生物体 内的一系列酶在发挥着作用。 酶保证了生物体内组成生命活动的大量生化反应 得以按照预定的方向有序、精确而顺利地进行，几乎 所有生物的生理现象都与酶的作用紧密相关，可以这 样说，没有酶的存在，就没有生物体的一切生命活动 。 天然酶的作用 利用酶作为催化剂进行生物催 化与生物转化，已成为生产精细化 学品、手性药物、食品添加剂等的 重要工具,获得了广泛应用。 随着酶催化应用范围的不断扩大和研究 的逐步深入，研究者发现，酶催化的精确 性和有效性常常不能很好地满足酶学研究 和工业化应用的要求，而且天然酶的稳定 性差、活性低使催化效率很低，还缺乏有 商业价值的催化功能 天然酶的局限 天然酶的局限性源于酶的自然进化过程。 现代生物工程的要求 天然酶需各种生物分子之间协调，工业酶主要 考虑活力与稳定性，能具备长期稳定性和活性 天然酶作用环境与应用环境的差异，能适用于 水及非水相环境 能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成 底物 能够在特殊环境中合成和拆分制作新药物或药 物的原材料 如何利用相对简单的方法以 达到对天然酶的改造或构建新 的非天然酶就显得非常有研究 意义和应用前景。 二、酶的定向进化简介 易错pcr、DNA改组、高突变菌株 1993年,美国科学家Arnold F H 首先提出酶分子的定向进化的概念 ，并用于天然酶的改造或构建新的 非天然酶。 蛋白质定向进化概念的提出 定向进化与自然进化比较 o 自然进化非常缓慢，环境的多样性和适应方 式的多样性决定了进化方向的多样性。 o 定向进化模仿自然进化的关键步骤：突变、 重组、筛选 酶分子研究 o 认识与改造 o 改造： 合理设计（化学修饰、定点突变） 非合理设计（定向进化、杂合进化） 人为地创造特殊的进化条件，模拟自 然进化机制，在体外对基因进行随机突变 ，从一个或多个已经存在的亲本酶（天然 的或者人为获得的）出发，经过基因的突 变和重组，构建一个人工突变酶库，通过 一定的筛选或选择方法最终获得预先期望 的具有某些特性的进化酶。 定向进化技术 o理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于 开发，这是酶的体外定向进化的基本先决条件. 所谓酶的体外 定向进化（directed evolution of enzyme in vitro）, 又称 实验分子进化（experimentally molecular evolution）, 属 于蛋白质的非合理设计（irrational design），它不需事先了 解酶的空间结构和催化机制1，通过人为地创造特殊的条 件，模拟自然进化机制（随机突变、重组和自然选择），在体 外改造酶基因, 并定向选择出所需性质的突变酶. 酶的体外定向 进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别 是能够解决合理设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能 研 究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和医药等领域逐渐 显示其生命力 定向进化的原理 定向进化随机突变选择 随机突变的策略 易错PCR技术(error-prone PCR) DNA改组(DNA shuflling)：由美国Stemmer 于1994 年首次提出 一项体外重组技术 随机引发重组(RPR) 1998 年,Arnold 提出了 一种有效的新方法 交错延伸技术(StEP)：由Zhao 等 提出, 是一 种简化的DNA shuffling 技术 易错PCR 易错 PCR（error prone PCR）是指在扩增目 的基因的同时引入碱基错配，导致目的基因随 机突变。 PCR:变性95、退火55、延伸酶的作用温度72 易错 PCR 是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩 增时，通过调整反应条件，如提高镁离子浓 度、加入锰离子、改变体系中四种的dNTPs 浓度或运用低保真度DNA聚合酶等，来改变 扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率 向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分 子的随机突变体。 o在待进化酶基因的PCR扩增反应中， 利用Taq DNA多聚酶不具有35 校对功能的性质, 配合适当条件， 以很低的比率向目的基因中随机引入突 变， 构建突变库。 连续易错PCR 连续易错PCR (sequential error prone PCR)策略。即将一次PCR扩增得到的有用突 变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反 复地进行随机诱变。 注：易错 PCR突变率需仔细调控，不能高低，靶基因取代碱基1.55个，经常一次突变很难获 得满意的结果。将一次易错 PCR获得的小突变累计产生重要的有益突变。 o Chen等人5，6用此策略使在非水相（二甲基甲 酰铵, DMF）溶液中定向进化枯草杆菌蛋白酶E的 活性获得成功，所得突变体PC3在60%和85%的 DMF中, 催化效率kcat/Km分别是野生酶的256和131 倍, 比活性提高了157倍. 将PC3再进行两个循环的定 向进化2, 产生的突变体13M的kcat/Km比PC3高 3倍(在60%DMF中), 比野生酶高471倍. 在该方法中，遗传变化只发生在单一分子内部, 故属于无性进化（asexual evolution）. 它较为费力 、耗时，一般适用于较小的基因片段（800 bp）. 此外, 使用该方法易出现同型碱基转换. 其他无性进化 o 化学诱导剂 o65度下直接用羟胺处理带有目的基因片段的质粒，内切酶切下突 变了的基因片段，再克隆表达 o致突变菌株 o注：遗传变化只发生在单一分子内部属于无性进化 DNA改组 DNA改组(DNA shuffling)又称有性PCR (sexual PCR)，原理如图所 示。 注：切割成随机片段，再进行不加引物的PCR循环，片段之间互为引物或模版，直到 获得全长的基因。该策略将亲本基因群中优势突变尽可能结合在一起。 DNA改组 o 该策略的目的是创造将亲本基因群中的突变 尽可能组合的机会, 导致更大的变异, 最终 获取最佳突变组合的酶. 在理论和实践上, 它都优于“重复寡核苷酸引导的诱变”和“连续 易错PCR”. 通过DNA改组, 不仅可加速积累 有益突变9, 而且可使酶的2个或更多的 已优化性质合为一体1015. 外显子改组 外显子改组(exon shuffling类似于DNA改 组，与但与其不同，它是靠同一种分子间内 含子的同源性带动，而DNA改组不受任何限 制，发生在整个基因片段上。 注：改造幅度小但更实际 o 外显子改组（exon shuffling）16，17 类似于DNA改组，两者都是在各自含突变的 片段间进行交换，前者尤其适用于真核生物. 在自然界中, 不同分子的内含子间发生同源重 组, 导致不同外显子的结合, 是产生新蛋白质 的有效途径之一. 与DNA改组不同,外显子改 组是靠同一种分子间内含子的同源性带动, 而 DNA改组不受任何限制, 发生在整个基因片段 上. 外显子改组可用于获得各种大小的随机肽 库. 杂合酶 o 杂合酶（hybrid enzyme）18是把来自不同 酶分子中的结构单元（二级结构、三级结构、功能 域）或整个酶分子进行组合或交换, 以产生具有所 需性质的优化酶杂合体. 有许多途径可以产生杂合 酶，如定位诱变、DNA改组、不同分子间交换功能 域，甚至整个分子融合. 杂合酶可用于改变酶学 或非酶学性质, 是了解酶的结构-功能关系、以及相 关酶的结构特征的有力工具，不仅如此，它还可以 扩大天然酶的潜在应用，甚至可以产生催化自然界 不存在的反应的新酶分子. 杂合酶方法的有效性和 实用性已得到了实验的证实1925 体外随机引发重组 体外随机引发重组(random priming in vitro recombination, RPR)以单链 DNA为模板，配合一套随机序 列引物，先产生大量互补于 模板不同位点的短DNA片段， 由于碱基的错配和错误引发 ，这些短DNA片段中也会有少 量的点突变，在随后的PCR反 应中，它们互为引物进行合 成，伴随组合，再组装成完 整的基因长度。 如果需要, 可反复进行上述过程,直到获 得满意的进化酶性质 o 该法优于DNA改组法的特点在于： （1） RPR可以利用单链DNA为模板, 故可1020倍 地降低亲本DNA量; （2） 在DNA改组中, 片段重新组装前必须彻底除去 DNase , 故RPR方法更简单; （3） 合成的随机引物具有同样长度, 无顺序倾向性. 在理论上，PCR扩增时模板上每个碱基都应被复制 或以相似的频率发生突变; （4） 随机引发的DNA合成不受DNA模板长度的限制 . 交错延伸 交错延伸(stagger extension process, StEP) 在PCR反应中把 常规的退火和延伸合 并为一步, 缩短其反 应时间，从而只能合 成出非常短的新生链 ，经变性的新生链再 作为引物与体系内同 时存在的不同模板退 火而继续延伸。此过 程反复进行，直到产 生完整的基因长度。 交错延伸 o StEP法重组发生在单一试管中, 不需分离亲 本DNA和产生的重组DNA. 它采用的是变换 模板机制, 这正是逆转录病毒所采用的进化 过程28. 该法简便且有效, 为酶的体外 定向进化提供了又一强有力的工具. 酶法体外随机-定位诱变 o 为解决空间结构未知酶的蛋白质工程问题, 我们曾以类胰 岛素样人参多肽基因和天冬氨酸酶基因为模型, 探索了一种酶 体外诱变的新途径, 即酶法体外随机-定位诱变(random-site- directed mutagenesis)2932. 该方法的内涵与酶的 体外定向进化类似, 对目的基因既采用随机突变增加突变位点, 以快速产生优质酶,又让其突变受到一定限制, 以减少筛选突变 体的工作量. 实际上, 该法也是体外模拟自然进化. 不同点在于 ，通过控制DNA合成的底物种类和浓度比例实现碱基对的错配 . 从上述策略不难看出,随着分子生物学技术的发展, 可以更 灵活、快速和简便地改造目的基因. 从功能出发, 先获得某优化 的突变体, 一方面可快速将其推向应用, 另一方面将对蛋白质的 理论研究起到更大的推动作用. 定向进化的筛选策略 琼脂板涂布法 在特殊条件下培养突变菌，通过宿主菌的生 长情况、培养基颜色、特定反应的出现等判断是否具有目的基 因。 微孔板悬浮法 在含生色底物平板上培养，挑取具有活性的 克隆接种到96孔板上检测吸光度。使用微流控芯片。 微球细胞固定法 与数字成像系统结合，将单个细胞附着在单 个固体珠上，突变体进行分离和筛选。 流式细胞计数法 细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，排 成单行，逐个通过流式细胞计数仪进行测定。 突变体分离 通过酶促反应的特征 加入底物显色 荧光共振能量转移 同位素标记底物 通过检测底物消耗或产物生成进行终点检测 酶检测 信号探测 分光光度计和荧光酶标仪 气相色谱和高效液相色谱 质谱和核磁 o通常, 筛选方法必须灵敏,至少与目的性质相关34，35. Venekei等人36报道了快速、有效地筛选蛋白水解酶突变 体的方法和最佳筛选条件, 主要是利用蛋白酶选择平板初选, 再 配合活性染色（activity staining）和X-光片消化分析（X- ray film digestion assay）加以验证, 并检测其活力, 快速筛 选了44 000个突变株. Roberts等人37用嗜菌体表面呈现技术筛选与嗜中性 酯酶结合力更强的抑制剂. 从含有4 900个突变体的基因库中 ，获得与该酶的结合能力高于野生蛋白质3.610 6倍的突变 体, 比已报道的任何一个相应的抑制剂高50倍38. 另有一些其他的筛选方法39，40, 如加入能产生可见 光信号的底物17或利用绿色荧光蛋白的荧光性质 41 等. 总之, 选择在酶的体外定向进化中至关重要,直接关系到其 成败. 定向进化与自然进化的异同点 定向进化的实质是达尔文进化论在分子水平上的延伸和 应用。 定向进化是在体外模拟突变、重组和选择的自然进化， 使进化朝着人们需要的方向发展。 两者的不同： 进化动力不同： 保守突变 非保守取代； 进化方向不同： 适应突变的积累； 进化速度不同： 非常漫长 只需几年、甚至几天； 进化目标不同： 适应环境 超越生物学意义的要 求，探索所希望的蛋白质在顺序空间的可及性。 定向进化的优势、现状和未来 o较之蛋白质分子的合理设计, 酶的体外定向进化属于非合理设计（irrational design）. 其突出的优点是, 不需事先了解酶的空间结构和催化机制. 它适宜 于任何蛋白质分子, 大大地拓宽了蛋白质工程学的研究和应用范围. 特别是它 能够解决合理设计所不能解决的问题11，4244，使我们能较快、较多 地了解蛋白质结构与功能之间的关系，为指导应用（如药物设计等）奠定理论 基础.此外,该技术简便、快速、耗资低且有实效. 总之, 酶的体外定向进化是 非常有效的更接近于自然进化的蛋白质工程研究的新策略. 它不仅能使酶进化 出非天然特性, 还能定向进化某一代谢途径; 不仅能进化出具有单一优良特性 的酶, 还可能使已分别优化的酶的两个或多个特性叠加, 产生具有多项优化功 能的酶，进而发展和丰富酶类资源; 完全在试管中进行的酶（或蛋白质）的体 外定向进化使在自然界需要几百万年的进化过程缩短至几年 10，这无疑 是蛋白质工程技术发展的一大飞跃. 目前，对一些酶（或蛋白质）(表1）、砷 酸盐解毒途径45、抗辐射性 46、生物合成途径47、对映体选 择性48、抗体库 49以及DNA结合位点定向进化50的可喜成果 令众多的相关科学家为之振奋. 可见, 进化能发生在自然界, 也能发生在试管 中，它与合理设计互补, 将会使分子生物学家更加得心应手地设计和剪裁酶（ 或蛋白质）分子, 将使蛋白质工程学更加显示出强大的威力和诱人的前景. 酶的体外定向进化应用实例 酶性 质突变方法参考文献 枯草杆菌蛋白酶E有机相活性/稳定性易错PCR2, 26, 27 -内酰胺酶总活力/底物专一性DNA改组7 枯草杆菌蛋白酶BPN稳定性盒式诱变51 对硝基苯酯酶底物专一性/有机相活性易错PCR/DNA改组9,10 胸腺嘧啶核苷激酶底物专一性盒式诱变52 -半乳糖苷酶底物专一性DNA改组17 绿色荧光蛋白荧光DNA改组41 核酶底物专一性易错PCR/DNA改组53 天冬氨酸酶活性与稳定性随机/定位诱变2932 药物和疫苗活性/专一性/最佳表达DNA改组54 定向进化技术 Fig. 1. Publication rate of the directed evolution articles in biomedical literature between 1995 and 2004. The analysis was achieved using the National Institutes of Health MEDLINE bibliographic database. The figure shows the total number of articles published each year, which contain the key words directed evolution in their titles. 目标酶所需功能方法结果实施菌种 卡那霉素核苷基 转移酶 热稳定性定位诱变+选择在60-50酶半衰期增 加200倍 耐热脂肪 芽孢杆菌 枯草杆菌蛋白酶作用于有机溶剂易错PCR+选择在60二甲基亚砜主 仆女冠活力增强170倍 枯草杆菌 -内酰胺酶作用于新底物DNA改组+选择对cefotaxime的抗性 增加32000倍 大肠杆菌 对硝基苯酯酶有机溶剂中的底 物特异性和活性 易错PCR+重组活力增加60-150倍大肠杆菌 胸苷激酶第五特异性 基 因理疗 交错延伸+选择活力增加43倍大肠杆菌 -半乳糖苷酶底物特异性DNA改组+选择活力增加66倍底物特 异性增加1000倍 大肠杆菌 砷酸脱毒途径砷酸抗性DNA改组+选择抗性增加12倍大肠杆菌 定向进化的应用 关键问题 应强调的是, 为了提高酶体外定向进化的成功率, 需注意以下几个关键 问题: （1） 确定目的酶在所需功能方面的进化程度和潜力; （2） 选择一个最接近人们需要的酶分子作为起点（包括用作下一循环的 起始突变体），这涉及将酶引入单一的进化途径，如果选择失误, 便 可能中途“夭折”; （3） 若用于理论研究, 应控制较低的突变率，只有选择最佳进化策略， 保证库中所有克隆只含有单一氨基酸取代(每代只有一个氨基酸变化), 那么从一代到另一代的功能变化便能与突变表型一一对应起来; （4） 建立有效且灵敏的选择方法, 确保检测出由单一氨基酸取代而引起 的功能变化. 目前, 已建立了一些酶（或蛋白质）的体外定向进化的有效方法, 但还应探索扩展定向进化潜力的最佳途径和提高对突变的控制能力. 选择方法尚待开发与完善, 有必要发展小型化分析和高度自动化的大 规模选择模式, 特别是对那些无明显可借鉴表型的突变体的选择, 可能 是今后该领域科学家切实努力的目标. 展望 总之，具有新功能和特性的酶可以通过从大 量未知的自然种系中寻找以及对现有的天然酶 进行改造，对现有的天然酶进行改造可能更加 合适。 我们相信，随着基因工程技术、蛋白质工程 技术以及高通量筛选技术的迅速发展，定向进 化技术将成为获得新酶的一个有效快捷的手段 ，这将为工业生产提供更多性能优良的酶制剂 。 参考文献 Nikolaos E. 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