《分子发光光谱》PPT课件.ppt

分子发光荧光、磷光和 化学发光法 2019/1/23 分子发光包括： 分子荧光（Fluorescence） 分子磷光（Phosphorescence） 化学发光（Chemiluminescence） 散射光谱（Scattering Spectrum） Date 荧光及磷光光谱法 一、 原理 第一次记录荧光现象的是16世纪西班牙的内科 医生和植物学家N.Monardes，他于1575年提 到，在含有一种称为“Lignum Nephriticum” 的木头切片的水溶液中，呈现出极为可爱的天 蓝色 以后逐步有一些学者也观察和描述过荧光现象 ，但对其本质及含义的认识都没有明显的进展 Date 直到1852年，对荧光分析法具有开拓性工作的 Stokes在考察奎宁和绿色素的荧光时，用分光 计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍为长 些，而不是由光的漫反射引起的，从而导入荧 光是光发射的概念，他还由发荧光的矿石“萤 石”推演而提出了“荧光”这一术语，他还研究 了荧光强度与荧光物质浓度之间的关系，并描 述了在高浓度或某些外来物质存在时的荧光猝 灭现象 第一个提出应用荧光作为分析手段的人 Date 1867年，Goppelsrode应用铝桑色素配位化合物的 荧光测定铝，这是历史上首次进行的荧光分析工作 19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928 年，才由Jette和West提出了第一台荧光计 进入二十世纪以来，荧光现象被研究得更多了，在理 论或实验技术上都得到极大的发展。特别是近几十年 来，在其他学科迅速发展的影响下，随着激光、计算 机和电子学的新成就等一些新的科学及技术的引入， 大大推动了荧光分析法在理论上及实验技术的发展， 出现了许多新的理论和新的方法 Date 磷光也是某些物质由紫外光照射发出的光，早 期并没有与荧光明确的区分 1944年，Lewis和Kasha提出了磷光与荧光的 不同概念，指出磷光是分子从亚稳的激发三重 态跃迁回基态所发射出的光，它有别于从激发 单重态跃迁回基态所发射的荧光 磷光分析法由于其有某些特点，几十年来的理 论研究及应用也不断得到发展 Date 分子发光的类型分子发光的类型 按激发的模式分类：按激发的模式分类： 按分子激发态的类型分类：按分子激发态的类型分类： 光致发光光致发光 化学发光化学发光/ /生物发光生物发光 热致发光热致发光 场致发光场致发光 摩擦发光摩擦发光 分子发光 分子发光 分子发光分子发光 荧光荧光 磷光磷光 瞬时荧光瞬时荧光 迟滞荧光迟滞荧光 按光子能量分类：按光子能量分类： 斯托克斯荧光斯托克斯荧光(Stokes)(Stokes)： ex ex em em 共振荧光共振荧光(Resonance)(Resonance)： ex ex = = em em 荧光荧光 （一）荧光磷光的产生 Date 电子重态示意图 激发三重态激发单重态基态单重态 Date 分子中电子的运动状态除了电子所处的能级外 ，还包含有电子的多重态，用M=2S+1表示， S为各电子自旋量子数的代数和，其数值为0或 1 根据Pauli不相容原理，分子中同一轨道所占 据的两个电子必须具有相反的自旋方向，即自 旋配对 若分子中所有电子都是自旋配对的，则S=0, M=1该分子便处于单重态(或叫单线态)，用符 号S表示 大多数有机化合物分子的基态都处于单重态 Date 基态分子吸收能量后，若电子在跃迁过程中， 不发生自旋方向的变化，这时仍然是M=1，分 子处于激发的单重态 如果电子在跃迁过程中伴随着自旋方向的变化 ，这时分子中便具有两个自旋不配对的电子， 即S=1, M=3，分子处于激发的三重态，用符号 T表示 处于分立轨道上的非成对电子，自旋平行要比 自旋配对更稳定些（洪特规则），因此在同一 激发态中，三重态能级总是比单重态能级略低 Date Date Date 其中S0、S1和S2分别表示分子的基态、 第一和第二电子激发的单重态 T1和T2则分别表示分子的第一和第二电 子激发的三重态 V=0、1、2、3、表示基态和激发态的 振动能级 Date 处于激发态的分子是很不稳定的，它可能通过 辐射跃迁和非辐射跃迁的形式去活化(去激发) 释放出多余的能量而返回基态 辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的 发射 无辐射跃迁是指以热的形式释放多余的能量， 包括振动弛豫、内(部)转移、系间跨(窜)越及外 (部)转移等过程 Date 荧光和磷光的产生过程中能量 传递方式及作用 振动弛豫 内转移 荧光发射 系间窜跃 磷光发射 外转移 延迟荧光 Date 振动弛豫(Vibration relaxation, VR) 指在同一电子能级中，电子由高振动能 级转至低振动能级，而将多余的能量以 热的形式发出 发生振动弛豫的时间为10-12s 数量级 Date 内转移 (Internal conversion, IC) 当两个电子能级非常靠近以致其振动能 级有重叠时，常发生电子由高能级以无 辐射跃迁方式转移至低能级 内转移的时间为1011S1013S数量级 Date 振动弛豫及内转移的速率比由高激发态 直接发射光子的速率快得多，所以，分 子吸收辐射能后不管激发到哪一个激发 单重态，都能通过振动弛豫及内转移而 跃迁到最低(第一)激发单重态的最低振动 能级 Date 荧光发射(Fluorescence emission, FE) 处于第一激发单重态的最低振动能级中 的电子跃回至基态各振动能级时，以光 的形式弛豫发射荧光 注意基态中也有振动弛豫跃迁 荧光的产生在10-610-9s内完成 Date 系间跨跃 (系间窜跃 ，Intersystem Crossing, ISC) 指不同多重态间的无辐射跃迁，它涉及到受激 发电子自旋状态的改变 这种跃迁是禁阻的(不符合光谱选律)，但如果 两个能态的能层有较大重叠时，就有可能通过 自旋轨道偶合等作用实现这一跃迁 系间窜跃的速度很慢，经历的时间较长 Date 磷光发射(Phosphorescence emission, PE) 电子由基态单重态激发至第一激发三重态的几 率很小，因为这是禁阻跃迁。但是，由第一激 发单重态的最低振动能级，有可能以系间窜跃 方式转至第一激发三重态，再经过振动弛豫， 转至其最低振动能级，由此激发态跃回至基态 时，便发射磷光 Date 磷光发射的跃迁仍然是自旋禁阻的，所 以发光速度很慢，磷光的寿命为104 100S 外光源照射停止后，磷光仍可持续一短 时间 Date 外转移(External conversion, EC) 指激发态分子与溶剂分子或其它溶质分 子的相互作用及能量转移，使荧光或磷 光强度减弱甚至消失。这一现象称为“熄 灭”或“猝灭” Date 延迟荧光 某些分子在跃迁至三重态后，通过热激 活有可能再回到第一电子激发单重态的 各个振动能级，然后再由第一电子激发 单重态的最低振动能级降落至基态而发 生荧光，这种荧光为延迟荧光 其寿命与磷光相近，但波长比磷光短 Date 分子的活化与去活化分子的活化与去活化 S S0 0 S S1 1 T T1 1 S S2 2 紫紫 外外 可可 见见 吸吸 收收 光光 谱谱 外转移外转移 紫紫 外外 可可 见见 共共 振振 荧荧 光光 光光 谱谱 内转移内转移 荧光荧光 系间系间 窜跃窜跃 磷磷 光光 反系间反系间 窜跃窜跃 迟迟 滞滞 荧荧 光光 振动弛豫振动弛豫 . . 无辐射跃迁的类型无辐射跃迁的类型 振动弛豫振动弛豫: : V V r r 1010-12 -12sec sec 外外 转转 移移: :无辐射跃迁无辐射跃迁 回到基态回到基态 内内 转转 移移: :S S 2 2 SS 1 1 能级能级 之间有重叠之间有重叠 系间窜跃系间窜跃: : S S 2 2 TT 1 1 能级能级 之间有重叠之间有重叠 反系间窜跃反系间窜跃: :由外部获由外部获 取能量后取能量后 T T1 1 S S2 2 . . 辐射跃迁的类型辐射跃迁的类型 共振荧光：共振荧光：1010-12 -12 sec sec 荧荧 光：光：1010-8 -8 sec sec 磷磷 光：光：110110-4 -4 sec sec 迟滞荧光迟滞荧光: :1010 2 2 1010-4 -4 sec sec Date （二）激发光谱曲线和荧光、磷光光谱曲 线 荧光和磷光均属于光致发光，所以都涉 及两种辐射，即激发光(吸收)和发射光， 因而任何荧光（磷光）化合物都具有两 个特征光谱：激发光谱和发射光谱，它 们都是荧光（磷光）定性和定量分析的 基本参数和依据 Date 萘的激发光谱及荧光和磷光的发射光谱 Date 1激发光谱 固定测量波长为最大发射波长，以荧光 或磷光强度激发光波长作图 通过激发光谱，选择最佳激发波长发 射荧光(磷光)强度最大的激发光波长，常 用ex表示 Date 2发射光谱 简称荧光（磷光）光谱。固定激发波长为最大激 发波长处，以荧光或磷光强度发射波长作图 荧光发射光谱显示了若干普遍的特性 Stokes位移 在溶液中，分子荧光的发射相对 于吸收位移到较长波长，称为Stokes位移 荧光发射光谱的形状与激发波长无关 镜像规则 通常荧光发射光谱和它的吸收光谱 呈镜像对称关系 Date 荧光激发光谱和发射光谱的特征 斯托克斯位移 在溶液荧光光谱中，所观察到的荧光发 射波长总是大于激发波长，emex Stokes于1852年首次发现这种波长位移 现象，故称Stokes位移 Date 斯托克斯位移说明在激发与发射之间存在着一 定的能量损失 激发态分子由于振动弛豫及内部转移的无辐射 跃迁而迅速衰变到S1电子态的最低振动能级， 这是产生其位移的主要原因 其次，荧光发射时，激发态的分子衰变到基态 的各振动能级，此时，不同振动能级发生振动 弛豫至最低振动能级，也造成能量的损失 第三，溶剂效应和激发态分子可能发生的某些 反应，也会加大斯托克斯位移 Date 荧光发射光谱的形状与激发波长无关 由于荧光发射是激发态的分子由第一激发单重 态的最低振动能级跃迁回基态的各振动能级所 产生的，所以不管激发光的能量多大，能把电 子激发到何种激发态，都将经过迅速的振动弛 豫及内转移跃迁至第一激发单重态的最低振动 能级，然后发射荧光。因此除了少数特殊情况 ，如S1与S2的能级间隔比一般分子大及可能受 溶液性质影响的物质外，荧光光谱只有一个发 射带，且发射光谱的形状与激发波长无关 Date 荧光激发光谱的形状与发射波长无关 由于在稀溶液中，荧光发射的效率(称为 量子产率)与激发光的波长无关，因此用 不同发射波长绘制激发光谱时，激发光 谱的形状不变，只是发射强度不同而已 Date 荧光激发发光谱与吸收光谱的形状相近似，荧 光发射光谱与吸收光谱成镜像关系 物质的分子只有对光有吸收，才会被激发，所 以，从理论上说，某化合物的荧光激发光谱的 形状，应与它的吸收光谱的形状完全相同 由于存在着测量仪器的因素或测量环境的某些 影响，使得绝大多数情况下，“表观”激发光谱 与吸收光谱两者的形状有所差别 如果把某种物质的荧光发射光谱和它的吸收光 谱相比较，便会发现两者之间存在着“镜像对 称”关系 Date 芘的苯溶液和硫酸奎宁的稀硫酸溶液 的吸收光谱和荧光发射光谱 Date 吸收光谱中的第一吸收带(波长较长的吸收带) 是由于基态分子吸收光能量被激发到第一电子 激发态的各不同振动能级，所以，其形状取决 于第一电子激发态中各振动能级的分布情况(即 能量间隔情况) 荧光光谱是激发态分子从第一电子激发单重态 的最低振动能级跃回基态中的各不同振动能级 所致，所以荧光光谱的形状取决于基态中各振 动能级的分布情况 一般情况下，基态和第一电子激发单重态中振 动能级的分布情况是相同的，所以荧光发射光 谱与吸收光谱的形状是类似的 Date 另一方面，吸收时由基态的最低振动能级跃迁 到第一电子激发态的各振动能级，振动能级越 高，所吸收的能量越大，即吸收峰的波长越短 相反 荧光发射是由第一电子激发单重态的最低振动 能级跃迁回基态的各振动能级，振动能级越大 ，所释放的能量越小，即发射的荧光峰波长越 长 Date 另外，由于电子跃迁的速率非常之快， 以致跃迁过程中分子中原子核的相对位 置没有明显发光的变化，其结果是，假 如吸收时由S0的v=0与第一激发态S1的 v=2 之间的跃迁机率最大(即强度最大)， 那么在荧光发射时，由S1的v=0跃回S0的 v=2的机率应该最大，基于上述原因，荧 光发射光谱与吸收光谱之间显现镜像对 称关系 Date Date （三）荧光的影响因素 分子产生荧光必须具备两个条件： 分子必须具有与所照射的辐射频率相适 应的结构，才能吸收激发光 吸收了与其本身特征频率相同的能量之 后，必须具有一定的荧光量子产率 Date 1. 量子产率 （） 通常用下式表示： =发射荧光的分子数/激发分子总数 =发射光量子数/吸收光量子数 荧光量子产率有时也叫荧光效率 磷光的量子产率与此类似 Date 2. 荧光与有机化合物的结构 （1）跃迁类型 对于大多数荧光物质来说，都是首先经历*或 n*激发，然后经过振动弛豫或其它无辐射跃迁，再 发生*或n*跃迁而得到荧光 *跃迁是产生荧光的主要跃迁类型 强荧光的有机化合物具备下特征 具有大的共轭键结构 具有刚性的平面结构 具有最低的单重电子激发态为S1为 * 型 取代基团为给电子取代基 Date 原因 吸收时 *跃迁的摩尔吸光系数比n* 跃 迁的大102103倍 * 跃迁的寿命(107109)比n* 跃迁 的寿命(105107)短，荧光发射的速率常数 Kf值较大，荧光发射的效率高。因此，* 跃迁发射荧光的强度大 在* 跃迁过程中，通过系间跨跃从单重态 跃迁至三重态的速率常数KISC也有利于荧光的 发射 Date （2）共轭效应 实验证明，容易实现*激发的芳香族化合 物容易产生荧光 增加体系的共轭度，电子的离域性越大，越容 易被激发，荧光也就越容易发生，且荧光光谱 向长波移动，荧光效率一般也将增大 共轭效应使荧光增强的原因，主要是由于增大 荧光物质的摩尔吸光系数，有利于产生更多的 激发态分子，从而有利于荧光的发生 Date 几种线状多环芳烃的荧光 Date 同一共轭环数的芳族化合物，线性环结 构者的荧光波长比非线性者要长，如蒽 和菲，其共轭环数相同，前者为线性环 结构，后者为“角”形结构，前者em为 400nm，后者em为350nm Date （3）刚性结构和共平面效应 一般说来，荧光物质的刚性和共平面性增加， 可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其它溶 质分子的相互作用减小，即使外转移能量损失 减小，从而有利于荧光的发射 而且刚性平面结构可以增大分子的吸光截面， 增大摩尔吸光系数，增强荧光强度 Date 不产生荧光不产生荧光 产生荧光产生荧光 产生荧光产生荧光 不产生荧光不产生荧光 F F =0.92=0.92 萘萘 V VA A F F ( ( 萘萘) )= = 5 5 F F ( ( V VA A ) ) 荧光黄荧光黄 酚酞酚酞 偶氮菲偶氮菲 偶氮苯偶氮苯 Date 在0.1mol/l的NaOH溶液中，荧光素荧光效率 达0.92，而酚酞却没有荧光 芴与联二苯，由于芴中的亚甲基使分子的刚性 平面增加，导致两者在荧光性质上的显著差别 ，前者荧光产率接近于1，后者仅为0.18 萘与维生素A都具有5个共轭键，而前者为平 面结构，后者为非刚性结构，因而前者的荧光 强度为后者的5倍 Date （4）取代基效应 芳香化合物具有不同取代基时，其荧光强度和 荧光光谱都有很大的不同 给电子基团增强荧光，吸电子基团减弱荧光 卤素取代基随原子序数增加而荧光下降 取代基的空间障碍对荧光也有影响 立体异构现象对荧光强度有显著的影响 荧光物质分子发生电离之后，其荧光性质也随 之发生变化 Date 给电子取代基使荧光加强 NH2，NHR，NR2，OH，OR， CN 基团上的n电子云几乎与芳环上的电子轨道平 行，共享了共轭电子，形成p共轭，扩大 了共轭体系。因此，这类化合物的荧光强度增 大 Date 考察这类取代基对荧光特性的影响时必 须注意，这类基团中的n电子容易转化为 共盐(共轭碱或共轭酸)，如酚在NaOH中 ，OH转化为O ，苯胺在酸中， NH2转化为NH3，它们的荧光均大为 减弱 Date 吸电子基团使荧光减弱而磷光增强 羰基(COOH，CHO，CO )，硝基( NO2)及重氮基等 基团都会发生n* 跃迁，属于禁阻跃迁 ，所以摩尔吸光系数小，荧光发射也弱， 而S1T1 的系间跨跃较为强烈，同样使荧 光减弱，相应磷光增强 二苯甲酮：弱荧光、强磷光二苯甲酮：弱荧光、强磷光 S S 1 1 T T 1 1 的的系间窜跃产率接近系间窜跃产率接近1 1 Date 硝基芳烃中NO2对荧光体荧光的抑制作用尤 为突出，硝基苯不发射荧光，其 S1T1的产率 为0.60。但令人费解的是硝基苯的磷光也很弱 ，普遍认为可能产生比磷光速率更快的非辐射 S1T1 的系间跨跃，或发生光化学反应 和给电子基团一样，吸电子基团也都存在n电 子，所以对极性溶剂及酸、碱介质都较为敏感 Date 取代基位置的影响 取代基位置对芳烃荧光的影响通常为： 邻位、对位取代者增强荧光，间位取代 者抑制荧光(CN取代者例外) Date 取代基的空间阻碍对荧光也有明显的影 响 Date 萘环上的8位引入SO3基时，由于空 间阻碍使NR2与萘之间的键扭转而减弱 了平面构型，影响了情况p共轭，导 致荧光的减弱 同样，1，2二苯乙烯的反式异构体是 强荧光物质，而顺式异构体不发射荧光 Date 荧光体取代上重原子后，荧光减弱，而磷光往 往相应增强 所谓重原子取代，一般指的是卤素(Cl、Br和I) 原子取代 芳烃取代上卤素原子后，其荧光强度随卤素原 子量增加而减弱，而磷光通常相应地增强，这 种效应称为“重原子效应”。这种效应被解释为 ，由于重原子中，能级之间的交叉现象比较严 重，使得荧光体中的电子自旋轨道偶合作用 加强，S1T1 系间跨跃显著增加，结果导致荧 光强度减弱，磷光强度增强 Date Date Date 卤代苯的荧光及磷光光谱的情况 Date 部分取代基对苯的荧光特性的影响情况表 Date 3. 无机化合物的荧光 某些无机盐类的荧光 常见的主要有镧系元素()的化合物，U()化 合物，类汞离子化合物 Tl()Sn()P()As()Sb()Bi()Se()等 这些化合物在低温(液氮)下都有较高的荧光效 率和选择性，因此常用低温荧光法进行测定 Date 金属螯合物的荧光 （1）螯合物中配位体的发光 （2）螯合物中金属离子的特征荧光 Date 螯合物中配位体的发光 这一类螯合物中金属离子的外层电子具有与惰 性气体相同的结构，为抗磁性的离子，它与含 有芳基的有机配位体形成螯合物时多数会发射 较强的荧光 这是因为原来的配位体虽有吸收光构型，但其 最低激发单重态的S1是n，*型，且缺乏刚性 平面结构，所以并不发荧光，而与金属离子配 合后，配位体变为最低激发单重态的， *型 ，且由于螯合物的形成而具有刚性平面结构， 因此能发射荧光 Date 8-8-羟基喹啉羟基喹啉 弱荧光弱荧光 8-8-羟基喹啉羟基喹啉-Zn-Zn螯合物螯合物 黄绿色强荧光黄绿色强荧光 2,2-2,2-二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯 无荧光无荧光 2,2-2,2-二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯-Al-Al螯合物螯合物 强荧光强荧光 Date T T1 1 系间窜跃系间窜跃 S S0 0 S S1 1 d d * * 、 f f * * d d * * d d f f * * f f 荧光荧光 分子内能量转移分子内能量转移 螯合物中金属离子的荧光 这些金属离子的次外层中具有未充满电子的d轨道或f轨 道，它们吸收光时，会发生dd* 或 ff*的吸收跃迁 。也会发生dd* 或 ff*的发光跃迁，但跃迁机率很 小，吸光及发光很弱 当与配位体螯合时，则首先是发生配位体的* 吸 收跃迁，而金属离子的d*或f* 能层在配位体激发后最低 激发单重态S1能层的下方，因而可以发生能量的转移 ，由S1转移给 d*或f* ，然后发生dd* 或 ff*跃迁， 使跃迁机率增大，发光强度增大 Date 4. 溶剂的影响 一般溶剂效应：指的是溶剂的折射率和介电常 数的影响，该效应是普遍的。一般情况下，折 射率加大，将使荧光光谱的Stokes位移减少， 而介电常数加大，将使Stokes位移加大，且荧 光效率提高 特殊溶剂效应：指的是荧光体和溶剂分子间的 特殊化学作用，它取决于溶剂和荧光体的化学 结构 Date 特殊溶剂效应对荧光光谱及强度的影响 往往大于一般溶剂效应。由于溶质分子 与溶剂分子间的作用，使同一种荧光物 质在不同的溶剂中的荧光光谱可能会有 显著不同 Date 有时，增大溶剂的极性，将使n*跃迁 的能量增大，*跃迁的能量减小， 而导致荧光增强，荧光峰红移 如8-巯基喹啉在四氯化碳、氯仿、丙 酮和乙腈四种不同极性的溶剂中荧光峰 和荧光强度（荧光效率）分别为： 390nm（0.002），398nm（0.041）， 405nm（0.055）和410nm（0.064） Date 但也有相反的情况 如苯氨萘磺酸类化合物在戊醇、丁 醇、丙醇、乙醇和甲醇五种醇中随着醇 的极性增大，荧光强度减小，荧光峰蓝 移 Date 如果溶剂和荧光物质形成了化合物或溶 剂使荧光物质的电离状态或存在型体改 变，则荧光峰位置和强度都会发生较大 的改变 如果溶液分子与荧光物质形成氢键，将 使荧光峰明显红移，荧光强度一般增大 Date 在含有重原子的溶剂（如溴化正丙酯等）中， 一般也使荧光体的荧光强度降低，而使磷光强 度升高，这种现象称为“外重原子效应” 溶剂中重原子的高核电荷引起溶质分子的自旋 与轨道之间强烈的偶合作用，结果使S1T1 的 系间的跨跃、磷光发射及T1 S0的系间跨跃等 过程的几率增大。因此荧光削弱，而磷光增强 Date 5. 温度对荧光强度的影响 温度对荧光强度的影响较敏感。温度上升，荧 光强度下降(这是因为分子内部能量转化作用和 溶液温度上升时介质的粘度降低，荧光物质与 溶剂分子的碰撞也随之增加) 荧光分析时一定要控制好温度 低温荧光可以提高灵敏度，已发展为荧光分析 中的一个重要分支 Date 不同温度下邻菲罗 啉的荧光光谱 Date 溶液不存在猝灭剂时，荧光的量子产率 与去激化的辐射跃迁过程及非辐射跃迁 过程的相对速率有关 一般认为辐射过程速度不随温度变化， 因此，荧光量子产率的变化反映了非辐 射跃迁过程速率的变化 Date 随着溶液温度的升高，介质粘度降低， 分子运动速度也变大，从而使荧光分子 与溶剂分子或其它分子的碰撞机率增加 ，外部能量转移速率变化。因此，荧光 产率降低 溶液温度上升而使荧光强度降低的另一 个主要原因是分子的内部能量转化作用 Date 多原子分子的基态和激 发态的位能曲线可能相 交或相切于一点。当激 发态分子接受到额外热 能而沿激发位能曲线 AC移动至交点C时，有 可能转换至基态的位能 曲线NC，使激发转化 为基态的振动能，随后 通过振动弛豫而丧失振 动能量 Date 6. 溶液pH值对荧光强度的影响 带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族 化合物的荧光一般都与溶液的pH有关 金属离子与有机试剂形成的发光螯合物 也受到溶液pH值的影响。pH既影响螯合 物的形成，又影响螯合物的组成，因而 影响它们的荧光性质 Date 在不同酸度介质条件下，荧光体的存在 型体不同，不同的型体(分子与其离子)在 电子构型上有所不同，而且基态和激发 态所表现出来的酸碱性也有所差别。因 此不同酸度下，荧光光谱和荧光强度都 可能发生变化 在荧光分析中一般都要较严格地控制溶 液的pH值 Date Date 7形成氢键的影响 荧光物质与溶剂分子或其他溶质分子所形成的 分子间氢键可能有两种情况 一种是在激发之前荧光体的基态所形成的氢键 ，这种情况一般使摩尔吸光系数增大，即吸收 增强，因此荧光强度增大，同时也可能发生分 子极性及共轭程度的变化。因此吸收光谱(荧光 激发光谱)及荧光发射光谱都可能发生变化 另一种情况是激发之后荧光体的激发态所形成 的氢键，所以吸收光谱(激发光谱)不受影响， 而荧光发射光谱会发生变化 Date 8有序介质的影响 表面活性剂 荧光体荧光体在由表面活性剂形成胶束的微环 境中，可以减少非辐射去激化过程和猝灭过程 的速度，提高荧光量子产率 由于表面活性剂参与组成更高次配合物（多元 配合物）而增大配合物分子的有效吸光截面积 ，导致摩尔吸光系数的增大，使荧光强度增强 在胶束溶液中，荧光强度增强，测定的灵敏度提 高 Date 表面活性剂（两亲分子） 能使水的表面张力明显降低的溶质称为表面 活性物质 这种物质通常含有亲水的极性基团和憎水的 非极性碳链或碳环有机化合物。亲水基团进入水 中，憎水基团企图离开水而指向空气，在界面定 向排列 表面活性剂在水中随着浓度增大，表面上聚 集的活性剂分子形成定向排列的紧密单分子层， 多余的分子在体相内部也三三两两的以憎水基互 相靠拢，聚集在一起形成胶束，这开始形成胶束 的最低浓度称为临界胶束浓度critical micelle concentration Date 临界胶束浓度 (critical micelle concentration) Date 胶束(micelle) Date 超分子化合物（环糊精） 一般有空腔，与荧光体形成主客体包合物 降低荧光体活动自由度 对荧光体起屏蔽作用 荧光强度增强 Date Date Date 9荧光的猝灭 从广义上说，指的是任何可使某给定荧光物质 的荧光强度降低的作用，或者任何可使荧光强 度不与荧光物质的浓度呈线性关系的作用 从狭义上说，荧光分子与溶剂分子或其它溶质 分子相互作用引起荧光强度降低的现象 这些引起荧光强度降低的物质称为猝灭剂 Date 荧光的猝灭的主要类型有： （1）碰撞猝灭 碰撞猝灭是荧光猝灭的主要原因 Date 相对速率 M + h M* (激发)1 M* k1 M + h(发生荧光)kfM* M* + Q k2 M + Q + 热(猝灭)KQM*Q M*为单重激发态荧光分子；Q 为猝灭剂；kf，kQ 为相应的反应速率常数 荧光猝灭程度与kf，kQ的相对大小和猝灭剂浓度 有关 溶液粘度增大，碰撞猝灭减小 温度增加，碰撞猝灭增加 Date 减少碰撞去激发的途径 降低温度 增大溶液粘度 把荧光(磷光)物质附着在固体上，支撑 物测定 Date 特别要指出的是磷光发射，因其平均寿 命较长，碰撞去激发的效应更大，所以 常采用低温磷光或固体磷光方法 Date （2）生成化合物的猝灭（静态猝灭） 指的是基态的荧光物质与猝灭剂反应生 成非荧光的化合物，导致荧光的猝灭 Date 从上式也容易推导出荧光强度与猝灭剂平衡浓 度之间的关系 式中(If)0及(If)q分别为加入猝灭剂Q之前及之后 的荧光强度，CM为荧光物质的总浓度 上面的关系式可以用于荧光猝灭法的定量分析 Date （3）能量转移（动态猝灭） 产生于猝灭剂与处于激发单重态的荧光 体作用后，发生能量转移，使猝灭剂得 到激发，其反应如下： M* + Q M + Q*(猝灭) 俗称 “内滤作用” Date （4）氧的猝灭作用 O2可以说是荧光和磷光的最普遍存在的猝灭剂 。对于溶液磷光来说，氧的猝灭作用是十分有 效的，通常观察不到溶液的室温磷光现象。而 对于溶液荧光来说，不同的荧光物质和同一荧 光物质在不同的溶剂中，对氧的猝灭作用的敏 感性有所不同 这可能是由于顺磁性的氧分子与处于单重激发 态的荧光物质分子相作用，促进形成顺磁性的 三重态荧光分子，即加速系间窜跃所致 Date （5）自猝灭和自吸收 当荧光物质浓度较大时，常会发生自猝 灭现象，使荧光强度降低。这可能是由 于激发态之间的相互碰撞引起能量损失 当荧光物质的荧光光谱曲线与吸收光谱 曲线重叠时，荧光被溶液中处于基态的 分子吸收，称为自吸收 Date （四）荧光强度 发射的荧光光强IF应正比于该系统吸收的 激发光的光强， IF=K（I0-I） （81） 式中I0是入射光强度，I是通过厚度为b的 介质后的光强，常数K取决于荧光效率 Date 根据比耳定律： I/ I0=10-bc (82) 式中是荧光分子的摩尔吸光系数，b是 液槽厚度，c是荧光物质的浓度 Date 将（8-2）式代入（8-1）式，即可得到 ： IF=KI0（1- 10-bc） （83） 展开（83）且当I0一定时可得： IF=Kc （84） Date 由此可见，在低浓度（bc0.05）时， 荧光强度与物质的浓度呈线性关系 当高浓度时，由于自熄灭和自吸收等原 因 ，使荧光强度与分子浓度不呈线性关 系，随着液槽厚度的增加，弯曲情况发 生在更低的浓度处 Date 二、荧光分析仪器 荧光分析使用的仪器可分为目视、光电 、分光三种类型 它们通常均由光源、用于选择激发光波 长和荧光波长的单色器（滤光片或光栅 ）、液槽及检测器组成 为了消除入射光及散射光的影响，荧光 的测量应在与激发光成直角方向上进行 Date 荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图 光源光源 氙氙 灯灯 激发单色器激发单色器 样品池样品池 光电倍增管光电倍增管 数据处理数据处理 仪器控制仪器控制 光源光源样品池样品池 激发激发 单色器单色器 检测器检测器 数据处理数据处理 仪器控制仪器控制 发射发射 单色器单色器 发射单色器发射单色器 问题：问题：荧光分光光度荧光分光光度 计与紫外计与紫外- -可见分光光可见分光光 度计有何异同点？度计有何异同点？ Date 紫外紫外- -可见分光光度计可见分光光度计: : 光源光源 样品池样品池单色器 单色器 检测器检测器 数据处理数据处理 仪器控制仪器控制 荧光荧光( (磷光磷光) )分光光度计分光光度计: : 光源光源样品池样品池 激发激发 单色器单色器 检测器检测器 数据处理数据处理 仪器控制仪器控制 发射发射 单色器单色器 Date 紫外紫外- -可见分光光度计可见分光光度计 测量池测量池( (吸收池吸收池) ) 荧光分光光度计荧光分光光度计 样品池样品池 I0 It I0 It IF,p Date （一）光源 光源应具有强度大、适用波长范围宽、 稳定等特点 常用光源有高压汞灯和氙弧灯 Date 高功率连续可调染料激光光源是一种新 型荧光激发光源。激光光源的单色性好 ，强度大。脉冲激光的光照时间短，并 可避免感光物质的分解 这种光源不需单色器和滤光片 但是仪器设备复杂，应用还不广泛 Date 高压汞灯光源高压汞灯光源 应用广泛的应用广泛的线光源线光源 253.7253.7 296.5 302.2 312.6296.5 302.2 312.6 313.2313.2 365.0 365.0 365.5 366.3365.5 366.3 404.7 435.8404.7 435.8 546.1 557.0546.1 557.0 579.0579.0 (nm )(nm ) 光源光源样品池样品池 激发激发 滤光片滤光片 检测器检测器 数据处理数据处理 仪器控制仪器控制 发射发射 单色器单色器 光源光源样品池样品池 激发激发 滤光片滤光片 检测器检测器 数据处理数据处理 仪器控制仪器控制 发射发射 滤光片滤光片 Date 氙灯光源氙灯光源 波长范围：波长范围：200800nm200800nm 工作压力工作压力：520 520 atmatm 启动电压：启动电压：2040 KV2040 KV 使用寿命：使用寿命：10002000 h10002000 h 应用最广泛的连续光源应用最广泛的连续光源 发射波长范围宽发射波长范围宽 发射光强度大发射光强度大 Date （二）滤光片和分光器 用滤光片为单色器时，以干涉滤光片的 性能最好 半宽度窄 透射率高 经得起强光源的长期照射 Date 较精密的荧光光度计均用分光器作单色器。目 前，分光器多采用光栅 光栅有两个：第一单色器用于选择激发波长， 第二单色器用于分离出荧光发射波长 一般是后者的光栅闪耀波长比前者长一些 闪耀波长为光栅最大衍射效率点 选择光栅时应尽量选择闪耀波长在实际需要波长附近 荧光发射波长大于激发波长 Date 闪耀波长：机刻光栅的输出最强光的波 长 光栅的线槽角闪耀角闪耀波长 Date （三）样品池 荧光分析的样品池通常用石英材料做成 与吸光分析法的样品池不同 荧光样品池的四面均为磨光透明面（Why?) 一般仅有厚度为1cm的池（Why?) 使用注意事项使用注意事项 波长范围波长范围容易破碎容易破碎沾污问题沾污问题 Date （四）检测器 简易的荧光计可采用目视或硒光电池检 测 较精密的荧光光度计均采用光电倍增管 检测 Date 消除拉曼光谱的干扰的方法有： 选用高分辨率的仪器 对纯溶剂的拉曼峰进行测定，然后在荧 光谱中进行校正 Date （五）荧光分析仪器的发展趋势 1进样方便、重现性好 2混合均匀 3进样体积小 4自动化 5智能化 6多道检测 Date （六）联用技术 1流动注射荧光分析法 2作为HPLC检测器 3作为CE检测器 Date 三、荧光分析方法及应用 （一）荧光分析方法的特点 1灵敏度高 与分光光度法比较起来，荧 光法的灵敏度要高2-4个数量级。它的测 定下限在0.10.001g/ml之间 因为荧光是从入射光的直角方向检测， 即在黑背景下检测荧光的发射 Date 2选择性强 荧光法既能依据特征发射 ，又能依据特征吸收来鉴定物质 3试样量少和方法简便 4提供比较多的物理参数 如激发光 谱、发射光谱、荧光强度、荧光效率、 荧光寿命等物理参数 Date 5应用范围不够广泛 本身能发荧光的物 质相对较少，加入某种试剂将非荧光物 质变为荧光物质来进行分析的体系也不 是很多 6由于荧光分析的灵敏度高，测定时对环 境因素敏感，干扰因素也较多 Date （二）定量 标准曲线法 （三）荧光分析法的灵敏度 与分光光度法比较起来，荧光法的灵敏 度要高2-4个数量级 Date （四）荧光分析法的应用 荧光用于定性分析较少，一般用于定量分析 可以进行荧光定量分析的物质可分为以下三类 ： 试样本身发光 试样本身不发光，但与一荧光试剂反应而转化 为发光物质 试样本身既不发光，也不能转化为发光物质， 但能与一发光物质反应生成一不发光的产物 Date 荧光分析具有灵敏度高，取样量少等优 点，现已广泛应用于无机、有机、生化 、医药和临床检验等各个领域中 1. 无机化合物 一般无机化合物 细胞内金属离子 Date 2有机化合物 一般有机化合物 生命物质 3酶分析及酶动力学及机理研究 Date Date Date Date 4生物反应活性中间体的研究 存在的困难： 反应速度快、寿命短 化学方法、物理方法 信号被掩蔽 化学计量学方法可用于多组分测 定，解决这一问题，如Kalman filtering, Monte Carlo 技术，人工神经网络，多元校正 ，偏最小二乘法，小波分析等 信号弱或检测不到 5荧光免疫法用于医学研究 Date BODIPYBODIPY探针细胞成像检测探针细胞成像检测NONO Bright-filed and fluorescence images of PC12 cells (activated with 12.5g/mL LPS) loaded with TMDCDABODIPY in the presence of L-Arg (1 mmol/L) 荧光成像 Date U973U973细胞的巯基化合物荧光成像细胞的巯基化合物荧光成像 TMPAB-o-M * 将材料的尺度在三维空间 进行约束，达到一定的临 界尺寸(10nm) 广义 量子点 CdS带隙（ev ） 熔点()结构相变所需 压力（Gpa） 宏观晶体 2.5 1600 9 纳米晶体4.5 400 2 Date 荧光量子点（半导体纳米晶体），主要 是一种由和族或和族元素组成 的纳米颗粒 狭义 Date 量 子 尺 寸 效 应 (A) Size-tunable fluorescence spectra of CdSe quantum dots (B) illustration of the relative particle sizes。From left to right, the particle diameters are 2.1 nm, 2.5 nm, 2.9 nm, 4.7 nm, and 7.5 nm。 Date 量子点独特的光学特性 很宽的激 发光谱 狭窄对称 发射光谱 一元激发、多元发射 Date 强 抗 光 漂 白 能 力 Date 两种大小不同的量子 点标记3T3小鼠的成 纤维细胞, 一种发射 绿色荧光, 一种发射 红色荧光 将发射红色荧光的量 子点特异地标记在F- 肌动蛋白丝上 发射绿光的量子点与 尿素和乙酸结合, 与 细胞核具有高亲和力 同时在细胞中观察到 红色和绿色的荧光 通过静电引力、氢 键作用或特异的配 体-受体相互作用 将生物分子结合在 量子点的表面 Date 三种标记了不同 颜色的量子点的 癌细胞注入到老 鼠的体内，并实 时活体荧光造影 ，可以清楚地看 见癌细胞的位置 活体成像 疾病诊断 Date 四、磷光分析法 （一）概述 为了获得较强的磷光，宜采取下列措施： 1增加试样的刚性 这种方法可减小质点的碰 撞几率，以减小无辐射跃迁 2固体磷光法 3胶束增稳磷光法 4重原子效应 5敏化磷光 Date 增加试样的刚性 增加试样的刚性可以减少质点间的碰撞几率， 从而减少无辐射跃迁的光活化过程，提高磷光 发射的几率，提高磷光强度 低温磷光就是基于这一原理而建立起来的。在 低温磷光分析中，液氮是最常用的合适的冷却 剂。在液氮温度（77K）下，所使用的溶剂具 有足够的粘度并能形成透明的刚性玻璃体，从 而有效地降低质点碰撞的能量外部转移，提高 磷光强度 Date 固体基质磷光法 基于测量吸附于固体基质（载体）上的有机物 质所发射的磷光而进行分析的 有效地阻止了质点的碰撞，可以进行室温磷光 测定 所用的固体载体种类很多 纤维素载体，如滤纸、玻璃纤维 无机物载体如硅胶、氧化铝、石棉、溴化钾 有机物载体如醋酸钠 某些聚合物淀粉、蔗糖、纤维素膜等 较常用的载体是滤纸和纤维素色层纸 Date 理想的载体 能将分析物质牢固地吸附在表面或基体 中，减少三重态碰撞猝灭等非辐射光活 化过程，增强磷光强度 本身不产生荧光背景 Date 胶束增稳磷光法 当溶液中的表面活性剂浓度到达临界胶束浓度 后，便聚集成胶束 磷光体进入胶束时，改变了磷光体的微环境及 定向的约束力，从而强烈地影响荧光体的物理 性质，增强了其刚性，减少了碰撞的能量损失 ，增强了激发三重态的稳定性，增强了磷光强 度，从而也可以实现室温磷光测定 Date 环糊精诱导 环糊精磷光体重原子微扰剂三元包 合物 一定的非流动性 对氧不敏感 Date 重原子效应 在含有重原子的溶剂如碘乙烷或溴乙烷 中，有利于系间跨越，使磷光增强 除了使用含有重原子的溶剂外，还可以 采用Ag盐、Pb盐或Tl盐等重金属原子盐 类 Date 敏化磷光 这种磷光产生的机理与一般磷光不同，情况比 较复杂。分析物质被激发后并不发射荧光，而 是经过系间跨越，转至第一激发三重态（T1） 。当有某种合适的能量受体存在时，发生了由 激发三重态的分析物质将能量转移到受体的激 发三重态T1 ，然后受体发生T1 S0跃迁 ， 便发射磷光 分析物本身并不发射磷光，而是引发受体发射 磷光 Date Date 应该指出，与间接荧光法一样，也可以 利用磷光猝灭效应，用间接磷光法测定 某些物质 Date （二）磷光分析仪器 磷光光度计由光源、激发光单色器、液 槽、发射光单色器、检测器等组成 Date 在设计磷光光度计时应考虑到下面两个 因素： 试样需在液氮下（77K）分析，以减小 猝灭效应的影响 激发必须按时开关，以在无荧光的情况 下观察磷光发射 Date 光学系统与荧光分光光度计的区别光学系统与荧光分光光度计的区别 光源光源样品池样品池 激发激发 单色器单色器 检测器检测器 数据处理数据处理 仪器控制仪器控制 发射发射 单色器单色器 切光器（斩波器）切光器（斩波器） 共振荧光：共振荧光：1010-12 -12 sec sec 荧荧 光：光：1010-8 -8 sec sec 磷磷 光：光：110110-4 -4 sec sec 迟滞荧光：迟滞荧光：1001010010-4 -4 sec sec 样品池与荧光分光光度计的区别样品池与荧光分光光度计的区别 样品池需要放在盛样品池需要放在盛液氮的石英杜瓦瓶液氮的石英杜瓦瓶内，来测定内，来测定低温磷光低温磷光 Date Date 斩波片 步进电机带动的两个斩波片用于 区分磷光与荧光，一个在激发光单色器 和液槽之间，另一个在液槽和发射光单 色器之间。同相时，测到的是磷光与荧 光的总光强；异相时，激发光被遮断。 荧光寿命短，立即消失，而磷光寿命长 ，故测到的仅为磷光。调节两个斩波片 的转速，可测出不同寿命的磷光 Date 磷光镜示意图 Date （三）分析方法及应