黑曲霉葡萄糖氧化酶在毕赤酵母smd1168中的表达.pdfVIP

原创性声明 1 1 1 1 1 1 kllllqll1111111111 y 2 3 2 9 2 8 6 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名：鼻盘益一 日期：丝! 兰! 篁：星 关于学位论文使用授权的声明 本人同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的印刷件 和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：螽盔 导师签名： 山东大学硕士学位论文 目录 中文摘要一3 英文摘要5 符号说明一8 材料1 3 方法1 9 结果3 0 讨论3 2 附表3 8 附 图_ 一3 9 参考文献4 5 致谢5 4 硕士期间主要研究成果5 5 学位论文评阅及答辩情况表5 6 山东大学硕士学位论文 c a t a l o g u e c h i n e s ea b s t r a c t 3 e n g l i s ha b s t r a c t 5 s y m b o l s 8 p r e f a c e 9 m a t e r i a l s 13 m e t h o d s 1 9 r e s u l t s 3 0 d i s c u s s i o n 3 2 a t t a c h e dt a b l e s 3 8 a t t a c h e df i g u r e s 3 9 r e f e r e n c e s 4 5 a c k n o w l e d g e m e n t s 5 4 p u b l i s h e da r t i c l e sd u r i n gm a s t e rd e g r e e 5 5 s t a t e m e n to fd e f e n s ea n d a c a d e m i cd i s s e r t a t i o nr e v i e w 5 6 2 山东大学硕士学位论文 黑曲霉葡萄糖氧化酶在毕赤酵母s m d l l 6 8 中的表达 专业：生物化学与分子生物学 研究生：郭元芳 导师：毕文祥 中文摘要 葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶，在分子氧的存在下，利用氧为电子受 体，专一性氧化1 3 d 葡萄糖生成d 葡萄糖酸内酯，同时消耗氧生成过氧化氢。 葡萄糖氧化酶在生物医学、食品工业等多个领域发挥着越来越重要的作用， 其主要分布于多种动物、植物和微生物中，但从动植物中获取g o d 量少且有 一定的局限性，而细菌产的g o d 也较少，最主要的生产菌株是黑曲霉和青霉， 但黑曲霉和青霉生产g o d 产量低、纯化工艺繁杂，因此用基因工程方法构建 更优良的g o d 生产菌株一直受到高度重视。 巴斯德毕赤酵母表达系统是目前应用最广泛的外源基因真核表达系统之 一，其蛋白表达量高，且被表达的蛋白中杂蛋白少。毕赤酵母还具有能够严 格调控外源蛋白的表达，对表达产物进行加工、折叠和翻译后修饰，以及可 将外源蛋白分泌至胞外等优点。与其它真核表达系统相比，毕赤酵母表达系 统更加快捷、方便、高效。 启动子是基因表达调控的顺式作用元件，也是影响基因表达的关键元件。 启动子在基因水平上的重要作用，不仅控制基因的表达水平，同时也控制着 基因表达的时空顺序，因此启动子的活性很大程度上影响着基因的表达水平。 而不同的启动子对同一种蛋白质所表现出的活性也往往是不同的。所以选用 合适的启动子对于提高基因表达水平，促进外源蛋白在毕赤酵母中的生成是 相当重要的。质粒p g a p z o t a ( 3 1 4 7 b p ) 是一种表达型载体，自身携带3 磷酸 甘油醛脱氢酶基因启动子可在毕赤酵母中表达多种重组蛋白，这是一种组成 型表达，无需其他诱导物。本研究利用从黑曲霉a c c c 3 0 1 6 1 克隆的g o d 基因 构建了含g a p 启动子的分泌型表达载体p g a p z qa g o d ，并在毕赤酵母 山东大学硕士学位论文 g s l l 5 、k m 7 1 和s m d l l 6 8 菌株中对其进行了表达，以期观察g a p 启动子对 不同毕赤酵母菌株g o d 蛋白表达水平的影响。 实验方法： 1 黑曲霉a c c c 3 0 1 6 1 基因组的提取以及葡萄糖氧化酶基因的扩增与测序； 2 。 葡萄糖氧化酶基因重组质粒的构建及电泳、p c r 、酶切、测序鉴定： 3 重组质粒电转化毕赤酵母s m d l l 6 8 ，并用p c r 扩增分析转化结果； 4 葡萄糖氧化酶s d s p a g e 蛋白电泳； 5 葡萄糖氧化酶活性分析； 6 温度及培养基p h 对毕赤酵母表达葡萄糖氧化酶的影响。 实验结果： 1 测序结果显示成功扩增得到了黑曲霉葡萄糖氧化酶基因； 2 成功构建了葡萄糖氧化酶基因重组质粒p g a p z a a g o d ； 3 筛选得到毕赤酵母转化子s m d l1 6 8 g o d ； 4 s d s p a g e 蛋白电泳结果显示葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中得到了表达； 5 s m d l 1 6 8 g o d 表达的葡萄糖氧化酶具有活性； 6 温度及培养基p h 显著影响葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的表达。 结论： 用黑曲霉a c c c 3 0 1 6 1 的葡萄糖氧化酶基因成功构建了葡萄糖氧化酶基因 表达载体p g a p z a a - g o d 。转化后，p g a p z a a g o d 相关d n a 片段已整合进 重组毕赤酵母s m d l l 6 8 g o d 基因组中。s m d l1 6 8 g o d 可高表达具有活性的 g o d ，在3 0 。c 、p h 6 的条件下，s m d l1 6 8 g o d 培养液上清g o d 酶活可达 1 0 7 1 8u m l 。 关键词：葡萄糖氧化酶；黑曲霉；毕赤酵母；基因表达；启动子 山东大学硕士学位论文 e x p r e s s i o no ft h ea s p e r g i l l u sn i g e r g l u c o s eo x i d a s eg e n ei n p i c h i ap a s t o r i ss m d l l 6 8 s p e c i a l t y ：b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y g r a d u a t e ：g u oy u a n f a n g s u p e r v i s o r ：b iw e n x i a n g a b s t r a c t g l u c o s eo x i d a s e ( g o d ) i sak i n do fa e r o b i c - d e h y d r o g e n a s e g o dc a t a l y z e s t h e 3 - d g l u c o s e t od g l u c o n o l a c t o n ea n dg e n e r a t e sh y d r o g e np e r o x i d ew i t h m o l e c u l a ro x y g e na sa ne l e c t r o n a c c e p t o r g o dh a sw i d e l yb e e na p p l i e di n b i o m e d i c i n e ，g l u c o s eq u a n t i t a t i v ea n a l y s i s ，m e d i c a lt e s t i n g ，f o o di n d u s t r y , a n d b i o s e n s o r s n a t u r a lg o di sm o s t l ye x p r e s s e di na n i m a l s ，p l a n t sa n dm i c r o g a n i s m s w h i l el e v e l so fg o d p r o d u c e df r o mt h ef o r m e rt w os o u r c e sa n df r o mb a c t e r i aa r e v e r yl o w a tp r e s e n t ，g o di sm a i n l yp r e p a r e da n dp u r i f i c a t e df r o ma s p e r g i l u s n i g e ra n dp e n i c i l l i u m ，b u tb o t h t h el o wp r o d u c t i v i t ya n dt h e c o m p l i c a t e d p u r i f i c a t i o np r o c e s sl i m i ti t sa p p l i f i c a t i o n i th a sb e e na t t a c h e dg r e a ti m p o r t a n c et o c o n s t r u c tb e t t e rg o d p r o d u c t i o ns t r a i nu s i n gg e n e t i ce n g i n e e r i n gt e c h n o l o g i e s p i c h i ap a s t o r i se x p r e s s i o ns y s t e mi so n eo ft h em o s tc o m m o nu s e de u k a r y o t i c e x p r e s s i o ns y s t e m sf o re x o g e n o u sg e n ee x p r e s s i o n ，w h i c hp r o d u c e sh i g hl e v e l so f s e c r e t o r yh e t e r o l o g o u sp r o t e i n s ，a n di ss i m p l yt ob ep u r i f i e d i na d d i t i o nt os t r o n g a n ds t r i c t l y r e g u l a t i n gt h ee x p r e s s i o no ft h eh e t e r o l o g o u sp r o t e i n s ，pp a s t o r i s p o s s e s s e sa d v a n t a g e si nr e g u l a t i n gt h ee x p r e s s i o np r o t e i n sf o rp r o c e s s i n g ，f o l d i n g ， p o s t - t r a n s l a t i o n a lm o d i f i c a t i o n ，a n ds e c r e t i n gp r o t e i n st oe x t r a c e l l u l a rm e d i u m m o r e o v e r , c o m p a r e dw i t h o t h e r e u k a r y o t i ce x p r e s s i o ns y s t e m s ，户p a s t o r i s e x p r e s s i o ns y s t e mi sm o r ee f f i c i e n t ，s i m p l e ，a n dc o s t - e f f e c t i v e p r o m o t e r sa r ec i s a c t i n ge l e m e n t so fr e g u l a t i o no fg e n ee x p r e s s i o na n da r e a l s ot h ek e ye l e m e n t st h a ti n f l u e n c eg e n ee x p r e s s i o n p r o m o t e r sc a ns i g n i f i c a n t l y a f f e c tt h el e v e lo f h e t e r o l o g o u sp r o t e i n se x p r e s s e d i npp a s t o r i sa n da r e 山东大学硕士学位论文 r e s p o n s i b l ef o rt h es p a c ea n d t i m eo r d e r si ng e n ee x p r e s s i o n b u tt h ea b i l i t yt o e x p r e s ss p e c i f i ch e t e r o l o g o u sp r o t e i n si nd i f f e r e n tpp a s t o r i ss t r a i n sa r en o tt h e s a m e t h e r e f o r ei ti sv e r yi m p o r t a n tt oc h o o s es u i t a b l ep r o m o t e r st oi n c r e a s eg e n e e x p r e s s i o na n df a c i l i t a t et h ep r o d u c t i o no ff o r e i g np r o t e i n si npp a s t o r i s t h e p l a s m i dp g a p z a ai s ak i n d o f s e c r e t o r ye x p r e s s i o nv e c t o r , c a r r y i n g 3 - g l y c e r a l d e h y d ep h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s eg e n ep r o m o t e r ( p g a p ) ，w h i c hc a n c o n s t i t u t i v e l ye x p r e s se x o g e n o u sp r o t e i n si np p a s t o r i sw i t h o u ta n yi n d u c e r i nt h i s s t u d y , t h eg o dg e n ef r o ma n i g e ra c c c 3 0 1 6 1w a sc l o n e dt o c o n s t r u c tt h e s e c r e t o r ye x p r e s s i o nv e c t o rw i t hp g a p , n a m e da sp g a p z a a g o d i no r d e rt o c o m p a r et h ed i f f e r e n te x p r e s s i o nl e v e lb e t w e e nd i f f e r e n tpp a s t o r i ss t r a i n su n d e r t h ec o n t r o lo fp g a p , t h ev e c t o r sw e r et r a n s f o r m e di n t op p a s t o r i sg s 115 ，k m 7 1 ， a n ds m d 116 8s t r a i n sr e s p e c t i v e l y m e t h o d s ： 1 e x t r a c t i o no fa n i g e rg e n o m i cd n af o l l o w e db ya m p l i f i c a t i o na n d s e q u e n c i n go f a n i g e rg o dg e n e ； 2 c o n s t r u c t i o n ，e l e c t r o p h o r e s i sa n a y l y s i s ，p c r ，r e s t r i c t i o nd i g e s t i o na n a y l y s i s a n ds e q u e n c i n go fr e c o m b i n a n tp l a s m i db e t w e e ng o dg e n ea n dt h es e c r e t o r y e x p r e s s i o nv e c t o rp g a p z a a ，n a m e da sp g a p z a a - g o d ； 3 t r a n s f o r m a t i o no ft h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp g a p z a a g o di n t ot h r e e d i f f e r e n tpp a s t o r i ss t r a i n s ，g s115 ，k m 71 ，a n ds m d116 8 p c rw a s p e r f o r m e dt oi d e n t i f yt h er e s u l t e dt r a n s f o r m a n t s ，g s 115 - g o d ，k m 71 - g o d ， a n ds m d116 8 一o fg o d r e s p e c t i v e l y ； 4 s d s - p a g e a n a l y s i so fg o d ； 5 g o de n z y m ea c t i v i t ya s s a y ； 6 i n f l u e n c e so ft e m p e r a t u r ea n dm e d i u mp ho ng o da c t i v i t y r e s u l t s ： 1 a n a l y s i s o fs e q u e n c i n ga n dc o m p a r i n gs h o w e dt h a tt h eo b t a i n e dd n a f r a g m e n tc o n t a i n e da n i g e rg o dg e n e ，o fw h i c hl e n g t h18 18b pw i t h o u t i n t r o ns e q u e n c e sa n de n c o d e d6 0 5a m i n oa c i d s ； 6 山东大学硕士学位论文 2 t h epp a s t o r i se x p r e s s i o nv e c t o rp g a p z a a - g o dw i t ha n i g e ra c c e 3 0 16 1 g o d g e n ew a ss u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e d ； 3 t h et r a n s f o r m a n ts m d116 8 一g o dw a s o b t a i n e d ； 4 r e s u l to fs d s - p a g ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h er e c o m b i n a n ty e a s t sc o u l d e x p r e s sa n i g e rg o dp r o t e i n 5 t h et r a n s f o r m a n ts m d116 8 一g o dc o u l d e x p r e s sa c t i v eg o d ； 6 t e m p e r a t u r ea n dm e d i u mp hc o u l ds i g n i f i c a n t l yi n f l u e n c et h ee x p r e s s i o no f g o d i n 户p a s t o r & e x p r e s s i o ns y s t e m s 。 c o n e l u s i o n ： t h ee x p r e s s i o nv e c t o rp g a p z a a - g o d c o n t a i n i n gt h ea s p e r g i l l u sn i g e rg o d g e n ew a ss u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e d a f t e re l e c t r o p o r a t i o n ，t h ep g a p z a a g o d r e l a t e dd n a f r a g m e n tw a si n t e g r a t e di n t og e n o m eo fp i c h i ap a s t o r 括s m d116 8 t h er e c o m b i n a n tp i c h i a p a s t o r i ss m d l16 8 一g o dc o u l de x p r e s sa c t i v ea s p e r g i l l u s n i g e rg o da th i g hl e v e l t h ea c t i v i t yo fg o di nt h ec u l t u r es u p e r n a t a n to f s m d l l 6 8 一g o dc o u l db eu pt o1 0 7 1 8u m la tt h ec o n d i t i o no f 3 0 。ca n dp h6 。 k e yw o r d s ：g l u c o s eo x i d a s e ；a s p e r g i l l u sn i g e r ；p i c h i ap a s t o r i s ；g e n ee x p r e s s i o n ； p r o m o t e r 7 山东大学硕士学位论文 缩写 a c r a p b i s b p d d h 2 0 e b e c o l i e d t a k b k d l b o d 英文全称 a c r y l a m i d e 符号说明 a m m o n i u mp e r s u l f a t e s b i s a c r y l a m i d e b a s ep a i r d i s t i l l e da n dd e i o n i z e dw a t e r e t h i d i u mb r o m i d e e s c h e r i c h i ac o l i e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d k i l o b a s e k i l o d a l t o n l u r i a - b e r t a n im e d i u m o p t i c a ld e n s i t y o p t i m e m r e d u c e ds e r u m m e d i a p a g e p b s p v d f r p m s d s t b e t b s t t e m e d 中文全称 丙烯酰胺 过硫酸胺 亚甲基双丙烯酰胺 碱基对 蒸馏去离子水 溴化乙锭 大肠杆菌 乙二胺四乙酸 千碱基对 千道尔顿 l b 培养基 光密度 无血清优化培养基 p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n p o l y v i n y l i d e n ef l u o r i d e r o t a t i o np e rm i n u t e 磷酸盐缓冲液 聚偏二氟乙烯 每分钟转速 s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基磺酸钠 t r i s b o r i ca c i d e d t ab u f f e r t r i s 硼酸盐缓冲液 t r i s b u f f e r e ds a l i n ew i t ht w e e n 2 0 t r i s 缓冲盐溶液 n ，n ，n ，n - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e 四甲基乙二胺 t r i s t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 山东大学硕士学位论文 让! - 刖罱 葡萄糖氧化酶( g l u c o s eo x i d a s e ，g o d ) 是一种需氧脱氢酶，目前在食品 工业、医用检测、葡萄糖定量分析、及生物传感器等多种领域均得到了广泛 的应用i l 。3 】。g o d 在葡萄酒酿造及食品行业中广受关注，在酿造葡萄酒过程 中，其可以降低酒精含量，并有效减少微生物污染。此外，葡萄糖氧化酶可以 用作生物燃料电池中的阳极催化剂，同时还是安培葡萄传感器糖中的识别元 件【4 】o g o d 是一种糖蛋白，是由大小为8 0k d 的两个相同亚基组成同二聚体， 非共价结合两个黄素腺嘌呤二核苷酸( f l a v i na d e n i n ed i n u c l e o t i d e ，f a d ) 辅酶 分子。g o d 是葡萄糖甲醇胆碱( g l u c o s e m e t h a n o l c h o l i n e ，g m c ) 氧化还原 酶家族中的代表性酶之一。g m c 家族包括众多具有重要工业用途，尤其是在 疾病诊断学领域发挥重要作用的酶，例如胆固醇氧化酶、乙醇氧化酶、氨基 酸氧化酶及吡喃糖氧化酶等。该家族成员具有类似的结构骨架，包括氨基末 端附近有一个腺嘌呤二核苷酸磷酸结合的p 0 【p 折叠，以及分散于基本序列中 保守序列的5 个其他片段【5 】。 g o d 催化d 葡萄糖( c 6 h 1 2 0 6 ) 氧化为d 葡萄糖酸内酯( c 6 h l 0 0 6 ) 。自 然界中某些真菌及昆虫内体可产生g o d ，其催化产物过氧化氢可对抗细菌及 真菌。g o d 通常是安全无毒害作用的，由其催化的反应在清除分子氧的同时 产生过氧化氢，利用这一特性，可将葡萄糖氧化酶用于食物的保存1 6 】。目前， 由微生物产生的葡萄糖氧化酶受到广泛关注1 7 】，其在食品、饮料、化学制品、 生物技术、药品、临床化学等方面得到广泛的应用。在g o d 的催化反应中， 能够产生大约2 0 0k j m o l 6 1 的大量热量。g o d 的这一电化学特性使其成为燃 料电池及生物感受器的重要组成部分。z a l d a k 等人1 8 j 利用粘度测量、吸光度、 差示扫描量热法以及圆二色谱分析等方法研究了葡萄糖氧化酶的热变性，发 现g o d 热变性之后结构紧密，呈熔球样。g o d 的热转换是不可逆的，并且 不受g o d 浓度的影响。 g o d 在不同行业中的应用及作为一种分析酶在生物工艺流程中作用日益 显著。真菌( 通常为黑曲霉或青霉菌) 天然生产g o d ，可产生一种胞外酶， 9 山东大学硕士学位论文 超过1 0 已被糖基化。有些酵母菌，例如多形汉逊酵母、酿酒酵母等，可通 过基因重组的方式表达g o d ，但由此产生的g o d 往往伴随高糖基化，同时 伴随g o d 酶活改变等【9 1 。g o d 最初从黑曲霉真菌中分离生产，这也是葡萄 糖检测及其他行业中所用g o d 的最常见来源。黑曲霉来源g o d 最重要的特 性是其对葡萄糖底物的高度特异性。报道指出，其他来源的g o d 也可氧化 其他单糖，如麦芽糖。早在2 0 世纪4 0 年代，就有研究指出葡萄糖氧化酶对 葡萄糖具有高度特异性，以及其在葡萄糖检测中的重要应用【l 训。 g o d 极具商业开发潜力，但其构象不稳定的特点大大限制了g o d 的研 究及应用。葡萄糖氧化酶的动力学特性以及其热稳定性，在很大程度上依赖 它的氧化还原状态。蛋白的糖基化可影响活性位点的构象动力学并最终影响 酶的活性【l 。但糖基化以何种途径影响g o d 稳定性目前尚不十分清楚。此 外，g o d 酶表面经合成的聚乙烯乙二醇长链修饰后，其熔点升高，并且体 外添加多元醇，如山梨醇或丙三醇，也可显著升高g o d 的熔点。报道指出， 黑曲霉g o d 比青霉菌g o d 更加稳定，但是青霉菌g o d 的底物亲和力是黑 曲霉g o d 的7 倍，其催化速率也接近黑曲霉g od 的4 倍【1 2 14 1 。 由黑曲霉产生的葡萄糖氧化酶会被氨基糖及中性糖糖基化，其中主要是 甘露糖样单糖【l5 1 。黑曲霉产生的g o d 与多种氧化底物作用从而使b d 葡萄 糖氧化。这些底物主要分为三类：分子氧、醌类及单电子受体。推测主要有 两种半还原反应机制：氢化物萃取及亲核攻击后去质子化。前者似乎更为可 信，p d 葡萄糖的一个质子从c 1 羟基转移到酶的一个基体( h i s 5 1 6 ) ，同时从 其c 1 处直接转移氢负离子至f a d 的n 5 ，最终氧化为6 葡萄糖酸内酯【l 引。氧 化反应采用单电子或双电子机制，取决于氧化底物的类型。g o d 的活性位点 包括黄素腺嘌呤二核苷酸( f l a v i na d e n i n ed i n u c l e o t i d e ，f a d ) 以及3 条氨基酸 侧链。g o d 的氧化酶活性占优势时，氧化反应以分子氧为电子受体，脱氢酶 活性占优势时，氧化反应使用人工电子受体。g o d 对分子氧的高反应性限制 了其在使用人工电子受体的生物传感器中的潜在应用。因此对氧低敏感性的 g o d 将非常有利于安培传感器的研发。h o r a g u c h i 及其同事构建了针对两种代 表性g o d ( 青霉菌g o d 及毕赤酵母g o d ) 的分子氧作用结构模型，根据胆 固醇氧化酶的晶体结构以及两种酶都是g m c 家族成员，预测分子氧参与的氧 化反应中起作用的残基。氨基酸置换导致g o d 氧化酶活性显著降低，而脱氢 1 0 山东大学硕士学位论文 酶活性显著增加，远远高于野生型g o d 酶的活性，重组g o d 的脱氢酶氧化 酶比值是野生型比值的1 2 倍。结果发现，g o d 的脱氢酶氧化酶比值发生改 变，使这些酶中推测在氧化反应中其重要作用的功能性残基发生突变，导致 脱氢酶活性进一步提高。该研究首次报道了g o d 电子受体从分子氧偏向人 工电子受体的改变f 1 6 , 1 7 。多种探针用于研究半氧化反应中分子氧的激活，包 括p h 依赖性、黏度效应、1 8 0 同位素效应以及溶剂同位素效应等对动力学参 数v m a x k m ( 0 2 ) 的影响。由于天然g o d 无法将电子转移至常规电极表面， 其无法用于第三代葡萄糖传感器。近年来，生物传感器研究热点主要集中在 酶的氧化还原中心与电极的连接方面。早在1 9 6 2 年，c l a r k 和l y o n s 详细报道 了电位测定方法偶联g od 检测血浆中葡萄糖含量【1 8 ，19 1 。该报告也介绍了创 建传感器时信号转导偶联酶的概念。酶偶联电化学传感器的成功部分归功于 酶对生物医学目的分析物的突出选择性，还要归因于电化学测量方法的简单 及敏感性。将酶与信号转导偶联，可提高测量时酶对特定底物的特异性。将 g o d 与信号转导偶联已成为生物传感器的标准模式系统 2 0 , 2 1 1 。第一个酶传感 器是通过利用葡萄糖氧化酶对葡萄糖的催化氧化反应，用分子氧电极来检测 血糖水平。第一代血糖监测系统以分子氧作为点知受体，通过检测分子氧消 耗量或者过氧化氢释放量来检测血糖浓度。第二代传感器使用人工电子受体 ( 也可称为电子介质或氧化还原染剂) 而不是分子氧作为电子受体，其目的 是为了避免受到其他氧化还原剂的干扰。然而，电子介质型氧化酶传感器本 就容易受样本中分子氧的溶解量影响。g o d 具有高转换率、高选择性，极佳 的热和p h 稳定性，并且成本低廉，这有利于g o d 的广泛应用( 2 2 2 5 】。 甲基营养型酵母毕赤酵母是g o d 重组表达的有效宿主菌，可产生大量适 当过甲基化的g o d ，其特性与天然g o d 略有差异。大肠杆菌e s c h e r i c h i ac o l i 通过基因重组方法产生的g o d 无明显生物活性，可经体外溶解、复性产生少 量有活性的非糖基化酶，其特性与天然g o d 相似。g o d 可被氧化反应中生 成的h 2 0 2 灭活【2 6 ，2 7 ，2 8 1 。p h 值降低，可能使d 葡萄糖酸内酯分解为葡萄糖酸， 也会抑制酶的活性【2 9 1 。 目前葡萄糖氧化酶的制备纯化主要来自于黑曲霉和青霉1 3 0 1 ，但其产量低 且纯化工艺繁杂 3 1 , 3 2 】，因此用基因工程方法构建更优良的g o d 生产菌株一 山东大学硕士学位论文 直受到高度重视。许多学者在g o d 重组菌的构建及优化产酶条件上做了许 多探索和研究 3 0 , 3 3 , 3 4 】。如周亚风等在毕赤酵母中表达了黑曲霉g o d ；母敬 郁等在瑞氏木霉中表达了黑曲霉g o d ；m a s a k iy a m a g u c h i 等实现了在毕赤酵 母中由3 一磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子( g l y c e r a l d e h y d e 3 一p h o s p h a t ed e h y g r o ge n a s eg e n ep r o m o t e r ，p g a p ) 调控黑曲霉g o d 在毕赤酵母中的表达。 本研究利用从黑曲霉a c c c 3 0 1 6 1 克隆的g o d 基因构建了含3 磷酸甘油醛 脱氢酶基因启动子( p g a p ) 的分泌型表达载体，并用其转化了毕赤酵母蛋白 酶缺陷性菌株s m d l l 6 8 ，以期实现g o d 在毕赤酵母中的高效表达。 山东大学硕士学位论文 1 1 菌株 材料 1 黑曲霉a s p e r g i l l u sn i g e ra c c c 3 0 1 6 1 由山东师范大学生命科学院生物技术系戴美学教授惠赠； 2 毕赤酵母p i c h i a p a s t o r i ss m d l1 6 8 购自美国i n v i t r o g e n 公司； 3 大肠杆菌ec o l id h 5 a 购自北京全式金生物技术有限公司。 1 2 质粒 质粒p g a p z a a 购自美国i n v i t r o g e n 公司。 1 3 主要仪器和试剂 1 3 1 黑曲霉基因组提取 ( 1 ) 主要仪器 超净工作台 m i l l i p o r e 纯水仪 高压灭菌锅 电热恒温鼓风干燥箱 k 5 6 0 0 超微量分光光度计 2 1 6 k 高速冷冻离心机 电子天平 一2 0 冰箱 1 3 5 低温冰箱 苏州安泰空气技术有限公司 美国m i l l i p o i 冱公司 上海申安医疗器械厂 上海精宏实验设备有限公司 山东爱博科技有限公司 美国s i g m a 公司 日本s h i m a d z u 公司 青岛海尔公司 日本s a n y 0 公司 ( 2 ) 试剂 o m e g as pf u n g a ld n ak i t 试剂盒美国o m e g a 公司 山东大学硕士学位论文 黑曲霉a c c c 3 0 1 6 1 的培养用马铃薯葡萄糖培养基：分别称取2 0g 葡萄糖， 2 0 0g 马铃薯以及15g 琼脂，溶解于8 0 0m l 蒸馏水中，搅拌至溶解，定容至 1 l ，自然p h 。高压蒸汽灭菌，待冷却后放入4 冰箱备用。 1 3 2p c r ( 1 ) 主要仪器 p c r 仪德国e p p e n d o r f 公司 m i n i s p i n 离心机德国e p p e n d o r f 公司 电子天平 日本s h i m a d z u 公司 k 5 6 0 0 超微量分光光度计山东爱博科技有限公司 水平板式电泳槽北京六一仪器厂 d y y - 8 c 型电泳仪北京六一仪器厂 a l p h a lm a g e r t m2 2 0 0 凝胶成像系美国a l p h a 公司 统 ( 2 ) 试剂 引物合成 琼脂糖凝胶回收试剂盒 2 t a qp c rs u p e r m i x 深圳华大基因有限公司 美国o m e g a 公司 北京全式金生物技术有限公司 引物设计： 根据g e n e b a n k 中的多个黑曲霉g o d 序列，利用p r i m e rp r e m i e r5 0 软件 设计引物p 1 和p 2 及p 3 和p 4 ( 表1 ) ，引物p l 和p 2 用于从a c c c 3 0 1 6 1 基因 组中扩增出含g o d 基因的约2 0k bd n a 片段。根据该d n a 片段测序结果及 质粒p g a p z o t a 上的多克隆位点，用引物p 3 和p 4 扩增具有酶切位点的g o d 基因。 1 3 3 质粒构建 ( 1 ) 主要仪器 m i n i s p i n 离心机 高速冷冻离心机 v o r t e x 5 德国e p p e n d o r f 公司 美国s i g m a 公司 海门市其林贝尔仪器制造有限公司 1 4 山东大学硕士学位论文 低盐l b 液体培养基的配制： 分别称取1g 蛋白胨、0 4gn a c i 及o 5g 酵母提取物溶于8 0m ld d h 2 0 中， 山东大学硕士学位论文 用i o mn a o h 调p h 至7 0 ，定容至l o o m l ，高压蒸汽灭菌，室温下冷却后置 于4 0 c 冰箱保存。 低盐l b + z e o c i n 液体培养基的配制： 向灭菌后冷却至室温的l b 液体培养基中加入z e o c i n 至终浓度为2 5 m l ，混匀，分装后4 0 c 保存。 低盐l b + z e o c i n 固体培养基的配制： 称取1 5g 琼脂粉加入1 0 0m ll b 液体培养基中，高压蒸汽灭菌，待培养 基温度降至5 0 0 c 左右时，依需加入z e o c i n ，快速摇匀后倒入无菌培养皿中， 培养基凝固后密封倒置，4 0 c 保存。 1 3 5 毕赤酵母电转化 ( 1 ) 主要仪器 电转化仪 高速冷冻离心机 k 5 6 0 0 超微量分光光度计 g e n ep u l s e rx c e l l e l e c t r o p o r a t i o n s y s t e