植物生理学实验-赤霉素对α-淀粉酶的诱导.ppt

赤霉素诱导-淀粉酶的合成 *提前打开水浴锅和分光光度计 赤霉素（GAs）是在研究 水稻恶苗病是发现的。 赤霉素的生理效应包括赤霉素的生理效应包括 促进茎的伸长生长（克促进茎的伸长生长（克 服遗传上的矮生性状）服遗传上的矮生性状） 、打破休眠、代替低温、打破休眠、代替低温 和长日照促进抽苔开花和长日照促进抽苔开花 、促进黄瓜雄花分化、促进黄瓜雄花分化、 促进坐果、诱导单性结促进坐果、诱导单性结 实等。实等。 一、实验目的一、实验目的 验证赤霉素对-淀粉酶诱导形成的生理作用; 掌握对该酶活性定性定量测定的原理与方法。 二、实验原理： 种子萌发过程中消耗贮藏物质，需要在一系列酶 的催化作用下才能进行。这些酶有的已经存在于 干燥种子中，有的需要在种子吸水后重新合成。 种子萌发过程中淀粉的分解主要在淀粉酶催化下种子萌发过程中淀粉的分解主要在淀粉酶催化下 完成。淀粉酶在植物中存在多种形式：完成。淀粉酶在植物中存在多种形式： -淀粉酶、淀粉酶、-淀粉酶淀粉酶 -淀粉酶存在于干燥种子中，而淀粉酶存在于干燥种子中，而-淀粉酶淀粉酶不存在于不存在于 干燥种子中，需要在种子吸水萌动后重新合成。干燥种子中，需要在种子吸水萌动后重新合成。 实验证明，启动-淀粉酶合成的化学信使是赤霉素。 如果没有胚释放赤霉素，-淀粉酶就不能合成。 赤霉素诱导-淀粉酶的合成 大麦种子萌发时胚中 产生的GA，通过胚乳扩散 到糊粉层细胞，诱导-淀 粉酶的形成，该酶又扩散 到胚乳使淀粉水解。 糊粉层细胞是GA作用 的靶细胞。 靶细胞：接受激素，并产生特异理化反应的细胞。 胚胚 释放 GAGA -淀粉酶基因表达淀粉酶基因表达 -淀粉酶淀粉酶 催化淀粉水解为糖催化淀粉水解为糖 糊粉层细胞 胚乳 赤霉素诱导-淀粉酶的合成 -淀粉酶淀粉酶 赤霉素诱导赤霉素诱导-淀粉酶的机制淀粉酶的机制 赤霉素和质膜上的受体 结合，通过膜上G蛋白介 导的信号传递系统，活化 细胞内既存的活化因子， 该活化因子进入核内使GA -MYB基因脱阻抑，合成GA -MYB蛋白。GA-MYB蛋白为 -淀粉酶基因启动子上转 录因子，诱导活化-淀粉 酶 mRNA的转录，最后翻 译成-淀粉酶，并分泌到 胚乳中发挥作用 外加的赤霉素可以代替胚的释放作用，从而 诱导-淀粉酶的合成。 这个反应非常专一，被用来作为赤霉素的生 物鉴定法。 去胚的吸胀大麦种子外加赤霉素，诱导-淀 粉酶形成，催化淀粉水解为糖。 实验证明： 大麦种子去胚后， 淀粉不分解； 去胚后，加GA处理， 淀粉水解； 去糊粉层，淀粉 不水解； 去糊粉层，加GA处 理，淀粉不水解。 （不产生GA） （缺少靶细胞） （缺少靶细胞） 这一性质已经应用于啤酒工业。 GA对大麦 糊粉层产 生-淀粉 酶的影响 无胚种子 碘（碘（ I2 KI）遇淀粉或糊精会出现不同的颜色。遇淀粉或糊精会出现不同的颜色。 淀粉的聚合度和生成碘包合物的颜色：淀粉的聚合度和生成碘包合物的颜色： 聚合度3.83.87.47.412.912.9 18.318.3 20.220.229.329.3 34.734.7以上以上 颜色无色淡红红棕红紫色蓝紫色蓝色 测定依据：测定依据：碘试法 淀粉可与淀粉可与 I I 2 2 -KI -KI 显蓝色，而淀粉分解的产物还原显蓝色，而淀粉分解的产物还原 糖不能与糖不能与 I I 2 2 -KI -KI 显色，可以定性和定量地分析显色，可以定性和定量地分析-淀粉淀粉 酶的活性。酶的活性。 通过碘试法，比色测定淀粉在酶催化反应过程中通过碘试法，比色测定淀粉在酶催化反应过程中 的消耗量，可以定性和定量地分析的消耗量，可以定性和定量地分析-淀粉酶的活力。淀粉酶的活力。 三、实验材料：三、实验材料： 大麦种子大麦种子 实验设计：实验设计： 无胚、无胚、 有胚、有胚、 无胚GA处理 GA32108mol/L 四、实验操作步骤 标准曲线的绘制（略）标准曲线的绘制（略） 取不同浓度的淀粉（0、10、20、30、40、50 g/ml）各2.0ml，分别加入I2-KI溶液2.0ml，蒸馏 水5.0ml，充分摇匀，于波长580nm下测定吸光度 值，以淀粉浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标制作 标准曲线。 C (C (gg/ml) = 151.97D/ml) = 151.97D580+ 0.058+ 0.058 R R 2 2 =0.9995=0.9995 (一）选种与切种: 注意注意: : 必须严格区分必须严格区分 有胚、无胚半粒有胚、无胚半粒, , 老师现场检查老师现场检查, , 出错者批评并扣分出错者批评并扣分! ! 选取大小一致、健康的大麦 种子80粒，用刀片将每粒种子 横切成两半，无胚的半粒和有 胚的半粒。 有胚 无胚 处理 编号 醋酸 缓冲液 ml 赤霉素液 ml 蒸馏水 ml 试验材料用量 P 1P 14 4 1 1 0 0 1 1 1010个有胚半粒个有胚半粒 O 5O 58 8 1 1 0 0 1 1 1010个无胚半粒个无胚半粒 G9G91212 1 1 1 1 0 0 1010个无胚半粒个无胚半粒 注：1ml溶液的吸取用1个枪头即可， 移取顺序醋缓、水、赤霉素溶液。 （二）淀粉酶的诱导 取12只离心试管，编号，按下表加入各种溶液和材料 于于3030下振荡培养下振荡培养2424小时小时 处理 重复 0.1淀粉 磷酸液 ml 培养液 ml 30 保温时间 min I2-KI 溶液 ml 蒸馏水 ml P 141.8有胚0.2摇匀1025 O 581.8无胚0.2摇匀1025 G9121.8 无胚+GA 0.2 摇匀1025 注：1.9ml、2ml、5ml溶液的移取用量程1000-5000L的加样器， 要使用配套的大号枪头，淀粉液、I2-KI、水 分别要换枪头。 0.1ml用小加样器和配套小枪头，培养液三种分别要换小枪头。 （三）淀粉酶活性分析（三）淀粉酶活性分析 从恒温振荡箱内取出昨日对应时间段培养的材料，按下表处理: 波长波长580nm580nm下测定吸光度下测定吸光度 比色应快速完成，避免延时误差. 空白: 1.8ml淀粉磷酸液 和0.2ml培养液换成磷 酸缓冲液，其它相同. 部分注意事项 测定测定-淀粉酶活性先使用其他班已经诱导淀粉酶活性先使用其他班已经诱导24h24h的溶液，的溶液， 每每4 4人取人取用震荡器内别人样品一套一套 ( (剩余倒掉剩余倒掉) )； 取用后用自己取用后用自己做好的补齐。处理编号必须准确，严格按处理编号必须准确，严格按 处理顺序排放，请放入相应时间的振荡器内。处理顺序排放，请放入相应时间的振荡器内。 0.1%淀粉磷酸溶液放置在冰箱内，用后请放回原处。 试管架上的试管和离心管用后请补齐，试管刷干净倒置 . 选种、切种 (严格区分有胚、无胚) 淀粉酶的诱导 (30下培养24h) 酶提液-昨日 0.1ml 30保温15min I2-KI溶液2.0mL 蒸馏水5.0mL 淀粉液 1.9ml 计算计算比色（比色（580nm)580nm) 空白为？ 操作 流程 赤霉素对赤霉素对 淀粉酶的诱导形成数据记载表淀粉酶的诱导形成数据记载表 无胚有胚无胚GA 重复1 重复2 重复3 重复4 平均值 淀粉含量 （四）结果计算 根据标准曲线计算淀粉的含量： C (g/ml) = 151.97D580+0.058 R2=0.9995 处理处理OO为淀粉的原始量（为淀粉的原始量（X X） 处理处理P P、G G分别为反应后淀粉的剩余量（分别为反应后淀粉的剩余量（Y Y） 淀粉水解量（%）= X-Y100 X * 需要对结果进行两两对比分析 思考题 1. 本实验为何要将大麦种子分成有胚和无胚半粒本实验为何要将大麦种子分成有胚和无胚半粒? ? 2. 2. 为何处理为何处理OO和处理和处理P P中都没有加入赤霉素溶液，中都没有加入赤霉素溶液， 但反应完后两者溶液的吸光值却不同但反应完后两者溶液的吸光值却不同 ? ? 3. 影响本实验效果的可能因素有哪些？试分析说明 其可能的影响是怎样的？如何改进？ 结果记录：记载表结果记录：记载表老师签字老师