《同位素示踪技术》PPT课件.ppt

第3章 同位素示踪技术 中国农业大学 齐孟文 第3章 同位素示踪技术 o 同位素示踪 通过同位素标记核素或同位素标记化合物 跟踪研究相关物体运动过程及其规律的一种研 究方法。 3.1 同位素示踪的基本依据和特点 依据 o 放射性同位素 元素的同位素具有 1)化学及生物学性质 同一的示踪性 2)物理性质差异的可 探测性 o 稳定性同位素 元素的同位素具有 1)化学及生物学性质 同一的示踪性 2)物理性质差异的可 探测性 3)同位素的天然组成 恒定 在水文、地理及生物学中，相关周期表中的同位素要览。点击黄色标 注的元素，即可链接到相应网页，可获得关于其特性及应用的简要说 明。LINK：USGS（ U.S. Geological Survey） 特点 o 放射性 1.测量灵敏度高 活度检 测限Amin=1Bq,相应物质的 质量检测限10-12 10- 17g 2.能与内源物质相区分， 可在生理稳恒条件进行代 谢研究。 3.样品制备及测定简便。 4.结合显影或显像技术可 进行定位定量或半定量测 定。 o 稳定性 1.现代质谱核素丰度测 定的精度可达0.01%. 2.利用同位素稀释原理 可计算样品中的物质 来自示踪剂的比率。 3.样品制备分析需大型 设备。 4.无放射性，无衰变， 无污染。有时是唯一 的。 3.2 标记核素与标记化合物 3.2.1放射性同位素 常用放射性核素 核素 半衰期 衰变方式 粒子 (MeV) 射线(MeV) 3H 12.3y- (100)0.0186 14C 5730y- (100)0.156 32P 14.28d- (100)1.711 35S 87.4 d- (100)0.167 45Ca 165d- (100)0.258 59Fe 44.6d- (100)0.274(45.8) 0.467(52.7) 1.566(0.3 . 3.2.1放射性同位素 标记化合物 化合物分子中某一元素的一个或数个普通核 素原子被其放射性同位素核素原子所替代。 1)标记方式 均匀标记U 标记原子在相应位置均匀分 布，丰度相同，由生物合成产生。 不定位标记G 标记原子在相应位置丰度 不同，由同位素交换法产生。 定位标记 标记原子在分子中有确定位置，由 化学合成产生。 2)制备 o 有机合成 简单标记化合物复杂标记化物 如： o 生物合成 饲喂标记前体生物系统生物大分子标记 化合物。 生物合成示例 o同位素交换 RH+T2 RT+ HT RH+T2O RT+THO 氚标可用所谓的气爆法进行.把底物涂到石英瓶内, 抽真空后,充入氚气,通过高频放电或紫外光照射使氚 气活化,促进交换.反应结束,抽吸剩余氚气,用易挥发 溶剂转移产物,最后除去溶剂. 3)特点 o 组成及总量不恒定 放射性纯度 所需放射性核素的活度占标记化合物制剂总 放射性活度的百分数。 放化纯度 在制剂中，标记核素在特定标记化合物中的活 度占该核素总活度的百分数。 放化纯度可用放射性薄层分析测定。 放化纯度说明示例 如碘-131的NaI制剂，除131I-，还可能有 131I2， 若放化I-131NaI 的放化纯度95%，则表示以其他化学状态存 在的碘1315%。 o 辐射自分解 标记化合物的辐射对其自身所产生的离解 作用。 o 微量和低浓度 操作量为微居里 (10-7-14g )，因浓 度低，单独不易沉淀，并易吸附损失，在操作 时常需加入同位素载体，以避免吸附或进行共 沉淀。 4)贮藏 o 开瓶分装,降低放射性溶液的浓度，降低比活度 。 o 低温(2-4)及避光保存。 3.2.2稳定性同位素 o 名词 核素的丰度 一种核素在其所属元素的同位素原 子中所占的原子百分数。 核素的自然丰度 核素在自然状态下的丰度。 核素的原子百分超 核素的丰度较自然丰度超出 的部分。 o常用核素 常用的稳定性示踪核素列表 Element Heavy isotopes Light isotopes H 2D (0.0156%) 1H (99.9844%) N 15N(0.366%) 14N(99.634%) C 13C(1.108%) 12C(98.892%) S 36S(0.02%) 34S(4.22%) 32S(95.02%) 33S(0.75%) O 18O(0.204%) 16O(99.759%) 17O(0.037%) o标记化合物 通过富集标记元素的稀有同位素核素 或贫化其普通同位素核素所形成的化合物 ，以及核素的自然丰度因环境而异有较大 的同位素分馏变异，带有原位标记“指纹 ”特点的化合物。 3.3 试验设计的一般原则和程序 3.3.1放射性同位素示踪 o 示踪剂的选择 考虑因素 核素(射线种类、 能量和半衰期)，标记方式 。 例：有机磷农药马拉硫磷残 留研究，14、32、35标 记均可，降解中的去甲基作 用 (14CH3)，酯键的水 解作用 (14，25 )，硫代磷酸脂键的反应， 用32P或15标记。 o示踪剂量的估算 引入量 标记化合物的用量，按一般实验要求确定 。 放射性总活度或比活度，要求能被精确测 量，而又不过强。 分无或有内源物示踪两种情况讨论。 o 无内源 此种情况下，示踪剂在系统中未被稀释,化合物的 比活度不变，示踪剂的比活度可由对样品活度的要求 直接估计得到。 式中,nmin 样品的最小计数，最好为2000 - 4000cpm;仪器的计数效率；W 试样重量；C 样 品中示踪物的含量。 若实验期间,放射性有明显衰变,应进行衰变校正 。 举例 无内源物质的示踪试验,如农药残留试验, 试样重1克,要求计数率达到2400 cpm,已知仪 器的探测效率为80%,若要求对样品的检测灵敏 度为0.1ppm,问示踪标记化合物的比活度至少 为多少. o 有内源 此种情况下，示踪剂在系统中被稀释。对示踪剂 比活度的估计，除要考虑仪器的探测效率和实验期间 放射性衰减外，必需考虑稀释作用的影响。示踪剂的 比活度可由如下两种方法之一估计。 估值法 式中，W，C为试样重及物质浓度或含量；Pdff为来自示 踪剂的比率。 倒推法 以盆栽为例，设植株总重M2 ，试样重M1 最低计数 率n (n4nb本底)。考虑： 不均匀分布因子P1 试样的平均计数率： 仪器的探测效率 试样的活度： 总样本量M2, 供试植株的总活度： 验期间的衰变 引入时植株的活度： A322 ， 植株的吸收利用率 应引入的活度： 回代得到： 举例 有内源物示踪实验示踪剂引入量的估计。以 32P标记肥料实验为例，设实验持续100d,测量样品 量取1g,植物平均含磷0.4%，其中来自肥料的比里 率为Pdff(10%-50%),按25%估算，若样品用固闪杯 法测量，仪器的探测效率为80%，要求计数率为 2000cpm,试估算32P标记肥料的比活度。 示踪剂的准备 开瓶分装 对商业制剂进行必要稀释 和转化的操作。 工作程序 1.核查包装说 例 磷32标记磷酸氢钠制剂 1)标记化合物名称 Na4 2)物理化学状态 溶液，无色透 明 3)溶液体积 5 mci/ml 4)比活度 0.5 mci/mmol 5)放射性总活度 2.5 mci 6)放射化学纯度 100% 7)测定日期 2000.3.12 8)包装情况 安培瓶盛装，再置 铝罐内。 2.确定稀释倍数 浓度稀释关系 S0V0 =S1V1 式中，S0、S1和V0、V1分别为稀释 前后制剂的放射性浓(ci/ml)， 及体积。 比活度稀释关系: a0m0=a1(m0+m1) 式中，a0、a1分别为标记化合物稀 释前后的比活度，m0和m1为标记化 合的质量和所加稳定性同位素载 体的质量。 示踪剂的准备 3.开瓶分装操作 采 用屏蔽和时间防护 等措施，妥善处理 废物。 4.使用前测定活度及 放化纯度，必要时 应纯化。 o示踪剂的引入 植物体 根部 水培、沙培、土培。 地上部 涂抹法、注射法、点滴法。 动物体 注射法、涂布渗入法、吸入法。 示踪剂引入系统示例 1Jim Rasmussen, el at, 2007. Soil Biology Biochemistry 39,804-815. 研究目的：套种体系碳、氮的转移、沉积和淋溶动态。 实验布置：田间微区，插入PVC柱，内径30cm。 示踪剂：14C-尿素，15N-尿素。 标记方法：叶缘吸收。植物叶片插入到盛有示踪液的小管 ，小管由布拉膜密封，持续标记5天。14C-尿素标记用 2ml管,盛1ml标记液，活度7.7106dpm(3.5Ci); 15N- 尿素用5ml管,盛2ml 0.75%(w/v) 丰度为99%的15N-尿素 标记液。在整个生育期14C标记重复3次，15N标记重复5 次。 2. Jessica L.Butler, el at,2004. Soil Biology Biochemistry 36,371-382. 研究目的：新固定的光合作用产物在植物根际的分布与周转。 实验布置：盆栽。 示踪剂：13CO2. 标记方法：整株饲喂。盆栽植物移入气密的透明有机玻璃光合室进 行标记，光合室长宽高为40.540.558.5cm3,每次标记11 个盆。13CO2在光合室直接发生,标记开始时监测光合室CO2的浓度 约为200ppm(v/v)，滴入1.5ml 1.5M乳酸到盛有含22.4mg NaH13CO3(13C丰度为99%),此时光合室CO2的浓度大约升到约 600ppm,待CO2的浓度降到200ppm，再在另一个含22.4mgNaH13CO3 管中发生13CO2,此时CO2升至400ppm,待其再次降到200ppm，将标 记盆移走，放入另一光合室内一段时间，以便使呼出的13CO2被 固定，使标记最大化。 3.Florian wechern, el at, 2007. Soil Biology Biochemistry 39,2527-2537. 研究目的：土壤根源性C和N的沉积及其归宿。 实验：田间小区。 示踪剂：14C-蔗糖，15N-尿。 标记方法：茎部饲喂。标记溶液1ml浓度2%(w/v),13C丰度 为99%的蔗糖和浓度0.5%(w/v)，15N丰度为99%的尿素。 引入方法,在距根部约3cm的茎处钻0.5mm的洞，用灯芯 与盛标记溶液的带盖试管相连，用硅胶密封连接处。 示踪研究举例 14CO2植物光合生理研究 目的： 测量光合强度，同化物的运转与分配，运转 机理，源与库的关系及其调节，研究作物高产的光合 生理。 1）14CO2标记 (14CO2+12CO2)的发生。 反应方程 (HClO4 ,H3PO4) Ba14CO3+Na2CO3 (14CO2+12CO2) 有关计量参量 光合作用二氧化碳的饱浓度为（0.12%-0.18%），一 般向光合作用室引入0.1% 0.2%浓度,最高不0.5%,4CO2 的放射性浓度(a )：整株标记，5Ci/L；标记单个器官， 几百kBq/L；标记大型树木，100 Ci/L。 设光合作用室的体积为V(L), 二氧化碳的浓度为 C(%),则,所需载体Na2CO3： Na2CO3+2 HClO4 CO2+2NaClO4+H2O 106 22.4 X VC 所需Ba14CO3的活度A=Va 发生过程： 在光合作用室内直接发生，或预先在实 验室发生，标记时注射法引入。 2）标记过程 光合室 用聚氯乙稀 （框或不框）封围供试 体，扎紧，保证气密， 在袋上封扎进气软胶皮 导管 。 用注射器定量吸取 发生好的 (14CO2+12CO2）注入 光合室，爆光30min后 ，抽出残气，用NaOH 吸收。 3）测样方法 o 固样 1050C杀青,800C烘干，磨碎.取100mg，低 本底计数或固闪杯法测量。 o 液样 用碱湿消化或然烧法制样后用液闪测量 。 4）结果分析 o14C分配率 o样品的采集和制备 采集 代表性 四分法缩减取样。 防止交叉污染 按活度由低到高顺序制备样品。 制备 把样品转化为适合测量与分析的形态,由析对 象和测量方式决定。 液闪样品的制备 均相 样品在闪烁液中形成溶液。 测量方式 非均相 乳浊液、悬浮液。 固体支持 样品吸附于滤膜再侵入闪 烁液。 o 均相样品制备法 1）溶剂提取法 侵渍法 样品匀浆振荡提取离心过滤 浓缩。 索氏抽提 用索氏器回流提取。 2）消化法 酸消化: 0.20.6ml 60%HClO4 50 100mg样品 0.2 0.4ml H2O2 注意14C有可能形成14CO2 ，该法淬灭较碱消化法的大。 碱消化: 常用无机碱或季胺碱： 1ml 2M NaOH+80100 mg样品 2ml 11.5M 海胺甲醇液+400-450mg样品 3)燃烧法 14CO 2 被碱性吸收液吸收 样品 T2O 吸收液配方： 甲苯 480 ml 乙氧基乙醇 400 ml 乙醇胺 120 ml 对142的回收率的96-98% PPO 6 g POPOP 0.2 g 3)燃烧法 甲苯 800 ml 乙氧基乙醇200 ml PPO 5 g 对3H水的回收率为96-98% POPOP 0.2 g o 乳化样品：使样品在闪烁体系中形成胶体或乳浊液。 700ml 甲苯+300ml Tritonx100+PPO (5g)+POPOP (0.5g) o 固体支持：样品滴加或沉淀在滤膜(滤纸、玻璃纤维 、醋酸纤维)，干燥后浸入闪烁液，相对测量。 o放射性测量数据的处理 1.射性计数的统计涨落 由于核衰变受随机过程支配，在测量条件及源强 不变条件下，放射性测量计数不是定值，而是围绕某 一定值上下涨落的随机变数，在计数N100时，其分 布可用正态分布描述： 实例 样 品1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Ni (2min)1880,1887,1915,1851,1874,1853,1931,1866,1980,1893 样 品11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Ni (2min)1976,1876,1901,1979,1836,1832,1930,1917,1899,1890 1.放射性计数的统计涨落 式中,M和分别是分布的数学 期望值和标准差，对于放射性 计数特别有 ，即只有 一个独立的统计特征量。 计数N出现在M区间 的概率： 2.统计误差 o 由一次测量结果或有限次测量的平均值作为计数期望值的估计 所引起的误差,一般用标准差N表示： 结果表示为： 标准误差的统计意义:由正态分布知，任何一个计数落在M 区间的概率: P(N-M)68.3% 反过来有: 因此，标准误差表示NN区间包含真平均值的概率为68.3%。 3.函数统计误差的运算 函数Zf(x,y)的误差传递公式 3.函数统计误差的运算 1)计数率 的误差o 计算上列第一次测量 的计数率及误差。 解: 3.函数统计误差的运算 2)平均计数 的 误差 3)平均计数率 的误差 o 计算实例所列数据的平 均计数率及误差。 解: 3.函数统计误差的运算 3)平均计数率的误差 4) 净计数率的误差，扣除本底的计率 3.3.2稳定性15同位素示踪 o 示踪核素的丰度选择 以15肥料利用率试验为例: 式中：W施肥量或产量，N含氮量(%)，a原 子百分超，R肥料利用率，f、p肥料或植物. o 样品采集与制备 采集：代表性和防止交叉污染。 制备：将样品中的氮转变成N2 供质谱或光谱分析15丰度 . 1)凯氏里屯伯格法 凯氏消煮 植物0.3-0.5g ( 1-1.5 mg N ) +5-10 ml H2SO 4 土壤1-2g 2小时 清亮后，继续 5小时 蒸馏定氮 在碱性条件，将氨蒸出并被硼酸吸收，然后用H2SO4滴 定测量全N。 样品全N含量 式中,V1 ，V