高通量测序样本.ppt

高高通量测序样本制备通量测序样本制备 葛芹玉 高通量测序样本准备的重要性高通量测序样本准备的重要性 各种不同类型的样本各种不同类型的样本 基因组DNA（resequencing） 宏基因组测序（也称微生物环境基因组，或元基因组） cDNA mRNA miRNA Methylation ChIP-chip Exon，Chrom etc 代表性问题：原始样本的完整性与量的问题、各种偏性、 误差、各种可能的污染等等。 测序样本制备测序样本制备 的基本流程的基本流程 样本核酸的获取（血液，组织 ，细胞，血清，） 测序文库制备 DNA文库 mRNA文库 miRNA文库 片段选择文库 编码文库编码文库 barcodebarcode 测序模板制备 乳液PCR 桥式PCR 滚环扩增 步骤繁琐 样本核酸准备 预处理（片段化，末端补 齐，片段筛选等） 通用接头连接 文库的预扩增（包括反转录等 ） 文库的精确定量 测序模板制备（单分子多拷贝 ） 上机测序 进一步处理测序模板 第一节第一节 测序文库制备测序文库制备 样本核酸（DNA/cDNA）的质控标准 DNA: 完整性 Total RNA: 完整性（Agilent） miRNA Pretreatment 某测序公司原始样本需求 1. 所需Total RNA的量均不少于20g/文库，Total RNA可以保存在DEPC 处理过的水中、75%的乙醇、异丙醇中，具体以什么方式保存请注明。 2. 如提供实验材料为动物组织材料，样品质量需大于2g； 3. 如提供实验材料为植物样品，样品质量需大于4g； 4. 如提供实验材料为培养细胞，请提供1107培养好的细胞； 5. 如提供实验材料为血液样品，请提供2ml的样品。 一、样本一、样本DNADNA等的等的片段化技术片段化技术 1 1、超声破碎技术、超声破碎技术 能量水平，时间，体积等参数 不足之处： 体积大 易污染 精度不够 Covaris S-series Covaris S-series 2010年1月5日报道安捷伦科技公司(NYSE: A)与 Covaris 公司于今日宣布了签订一项合作开发市场协 议，该协议表明，未来Covaris S2 DNA剪切技术将 与安捷伦 SureSelect 靶向序列捕获系统一起销售，以 提高新一代测序实验的效率。 Covaris Adaptive Focused Acoustics (AFA) 浓度不同长度不同物种不同 一些比较理想的结果一些比较理想的结果 体会： 有很大的损失 不同的样本需要不同的优化，没有现成可直接用的条件 2 2、片段化酶、片段化酶 最初是利用限制性内切酶（Endodeoxyribonuclease）或DNA 酶I（Deoxyribonuclease I）配合Mn2+将DNA大片段切割成小 片段 针对新一代的高通量测序平台，已经有多家公司开发了配套的酶 切试剂，多数是利用几种酶组合而成，其中包含一种可以在双链 DNA上有随机识别位点的酶将双链DNA制造切口，然后由另外一 种酶将切口处的单链DNA切断形成双链DNA片段 Fragmentase：该片段化酶产品包含着两种不同功能的酶，其一 可以实现在DNA双链分子上随机制造切口（nick），另一种酶可 以识别这种切口并且在互补链对应处制造缺口，从而完全从该处 断开双链DNA，从而实现只需根据反应时间的长短获得不同长度 的DNA片段，范围为100800 bp DNA。不同的处理反应时间 获得的长度有所差异，但是这种处理方法对原始样品的需求较大 ，而且对于目前主流的二代测序技术而言，还需要进一步切胶选 择特定的片段，而且该商品对于不同样品的反应效果均一性有待 进一步验证 FragmentaseFragmentase（NEBNEB） Generates dsDNA breaks in a time-dependent manner to yield 100800 bp DNA fragments depending on reaction time. 损失相对较小 集中程度不高，需要后续的片段选择 3 3、HydroShearHydroShear lThe Hydroshear is used for fragmenting DNA to sizes larger than 1KB. lThe HydroShear offers the simplest, most reproducible, and most controllable method available for generating random DNA fragments. lVirtually any source of DNA at any concentration in volumes as small as 40l can be randomly fractured to within a two-fold size distribution. For instance, if your target size is 2kb, you can calibrate the HydroShear to produce a distribution centered on 2kb with 90% of your DNA falling between 1.3 kb and 2.6kb HydroShearHydroShear HydroShearHydroShear 我们的结果我们的结果 可以实可以实 现自动现自动 清洗的清洗的 新设备新设备 4、雾化法（Nebulization） DNA雾化仪的工作原理如下： 高压氮气从顶端压入，通过两 侧的进气道对底部的DNA缓冲 液混合物产生压力，液体顺着 中部细管上升至顶部。顶部出 液口处有筛子之类的东西， DNA通过“筛子”，被打成小 片段。通过调节压力大小，可 以把DNA打成所需要的bp长度 。在使用之前DNA必须经过纯 化。 雾化法雾化法DNADNA片段化片段化 通常采用的DNA溶液体系为：1g-g经纯化的基因组DNA溶解 于50 L 的TE，并加入700 L nebulization buffer。对DNA进行 雾化分钟，气体压力为32-35psi（Pounds per square inch。P 是磅pound，S是平方square，I是英寸inch），雾化环境为冰浴。 所得的典型结果为DNA打碎至01200 bp，峰值为5600 bp 雾化法与更早期的酶切法相比，可重复性相对较好，并且对于所处 理的DNA序列没有选择性，非常快速并且便宜。但是所得的DNA分 子片段长度的区间非常大，使得处于可用区间200 20bp 的片段 仅占10%左右。为了满足新一代测序的要求，必须要选择长度较为集 中的片段，增加的纯化筛选造成了样本DNA的大量流失。这一缺点 不仅使成本增加，而且使得痕量DNA的研究难以实现，因而商业推 广价值较小。通量较低也是其显著缺点。目前已经基本被CovarisTM 超声仪进行超声打碎替代。 片段化方法比较片段化方法比较 数字表达谱数字表达谱 二、二、Fragment RFragment Recoveryecovery（Size Size selectionselection） 1、传统切胶回收 操作复杂 专门试剂盒 效率低 高效试剂盒开发？ 2 2、改进型的凝胶回收、改进型的凝胶回收(E-gel)(E-gel) l7分钟内完成DNA分离（50bp- 10kb） l选择琼脂糖浓度为0.8%、1.2%或 2%且结合有SYBR Safe或溴化乙 啶DNA染料的E-Gel l无需紫外线即可实时显示DNA迁移 ，灵敏度超高 l快捷简单的DNA条带提取 l适合低、中、高不同通量 3 3、新、新的仪器的仪器设备设备 Caliper的Labchip XT全自动DNA片段 回收仪等 前期投入大 耗材昂贵 回收载量低 4 4、新的试剂、新的试剂 bead-based size selection 磁珠法纯化试剂：可以进行某特定片段区域的选择 E-Z 96 Mag-Bind Oligonucleotide Purification Kit Agencourt Bioscience AMPure Beads AMPure XP Beads NEB next generation series Agencourt AMPure Agencourt AMPure XP Beads XP Beads SPRI works SPRI works Fragment Library Fragment Library SystemSystem Beckman Coulter has created a simplified automated workflow that utilizes Solid Phase Reversible Immobilization (SPRI) paramagnetic bead based technology to create an automated system for fragment library preparation for the Illumina Genome Analyzer. 三、三、End-repairEnd-repair T4 DNA Polymerase（3-53-5外切）外切） E. coli DNA Polymerase I (Large (Klenow) Fragment) （5 -35 -3聚合）聚合） T4 Polynucleotide Kinase（55磷酸化磷酸化 ） 四、通用接头连接四、通用接头连接 平末端连接 粘性末端连接 接头自连接问题？ Forked adaptorForked adaptor（illuminaillumina） Single reads adaptor Pair-end adaptor DNA连接酶的作用机制 细菌的DNA连接酶以 NAD为能源，动物细胞 和噬菌体的连接酶以ATP 为能源。T4的DNA连接 酶可以连接平末端。 尼克酰胺单磷酸 腺苷基 连接酶连接酶 DNA连接酶 RNA连接酶 五、各种类型测序文库的构建五、各种类型测序文库的构建 Fragment Pair-end Mate-pair DNA/mRNA/miRNA ChIP-Seq/MeDIP-Seq/转录组 /表达谱等 等 1 1、Fragment Library/single-read Fragment Library/single-read LibraryLibrary 单端测序(Single-read)首先将DNA 样本进行片段化处理形成200- 500bp的片段，测测序引物序列连连接 到DNA片段的一端，然后末端加上 接头，将片段固定在flow cell上生 成DNA簇，上机测序单端读取序列 。 2 2、Paired-end Paired-end librarylibrary Paired-end方法是指在 构建待测DNA文库时 在两端的接头上都加上 测测测测序引物序引物结结结结合位点合位点，在 第一轮测 序完成后，去 除第一轮测 序的模板 链，用对读测 序模块 (Paired-End Module)引 导互补链 在原位置再 生和扩增，以达到第二 轮测 序所用的模板量， 进行第二轮互补链 的 合成测序(图2)。 Mate-pair文库制备旨在生成 一些短的DNA片段，这些片 段包含基因组中较大跨度(2- 10 kb)片段两端的序列，更具 体地说：首先将基因组DNA 随机打断到特定大小（2-10 kb 范围可选）；然后经末端修 复，生物素标记 和环化等实 验步骤后，再把环化后的 DNA分子打断成400-600 bp的 片段并通过带 有链亲 和霉素 的磁珠把那些带有生物素标 记的片段捕获。这些捕获的 片段再经末端修饰和加上特 定接头后建成mate-pair文库， 然后上机测序。 3 3、Mate-pair LibraryMate-pair Library Mate-pair LibraryMate-pair Library（ABIABI） 短序列测序中需要考虑拼接的问题 4 4、编码文库、编码文库: : barcode/Indexbarcode/Index 编码文库 的必要性 两端编码 Indexing (illumina)Indexing (illumina) 5 5、Small RNA library Small RNA library 问题 解决办法 SOLiDillumina 改改进进的的miRNAmiRNA测测序文序文库库制制备备 6 6、Target Target Capture Capture SequencingSequencing / Selection / Selection librarylibrary Molecular Inversion Probe（ MIP） 靶标富集靶标富集 为了在大样本量中充分发挥新一代测序技 术的潜能，科学家们开发出几种方法，来 选择性富集目标区域。与全基因组测序相 比，富集后再测序降低了成本，也减轻了 后续数据分析的压力，让研究人员能够轻 松利用新一代测序的通量。目前有几种靶 向富集方法，包括分子倒置探针连接测序 （MIPS）、基于寡核苷酸杂交 三种富集技术：罗氏NimbleGen的 SeqCap寡核苷酸杂交型芯片捕获，安捷 伦的SureSelect寡核苷酸杂交溶液型捕获 以及Raindance的多重PCR方法的方法。 三种富集三种富集技术技术比较比较 为了评估这些方法在ABI SOLiD 3系统上 表现如何，来自迈阿密大学米勒医学院以 及Life Technologies的研究人员评估了 三种富集技术。结果发表在plos one上。 对于三种方法来说，目标区域都是相同的 ，大约0.8 Mb。富集以及测序之后，利 用几个指标来分析SOLiD测序结果，包括 各样品间覆盖深度的一致性、击中（on- target）和脱靶（off-target）效率、等 位基因偏向以及与芯片数据的基因型一致 性。 安捷伦的SureSelect表现出优异的击 中效率以及各样品间读取深度的一致性 。在读取深度为20倍及以下时， NimbleGen的性能很相似。 Raindance和NimbleGen SeqCap的 读取深度都更严格分布在平均值左右， 但击中效率却不如SureSelect。在分 析设计上，Raindance表现出最好的 多功能性。它靶定了目标区域的97% ，这对于诊断性的重测序可能很有用。 外显子测序 转录组测序 表达谱测序 MeDIP-Seq ChIP-Seq 7 7、Other Sequencing Library Other Sequencing Library Preparation Preparation 外显子测序外显子测序 转录组测序测序转录组测序测序 全转录组总RNA polyT富集mRNA去除rRNA Non-coding RNA转录组mRNA RNA片段化、纯化、检测产量 连接两端接头序列 逆转录生成cDNA 选择适当长度cDNA进行扩增 纯化扩增产物，评估产量 上机进行高通量测序 转录组测转录组测转录组测转录组测 序序可以得到特定 条件下所有mRNA转录 本 的丰度信息，从而发现 新 的转录 本和可变剪接体 基因表达基因表达谱谱谱谱(gene expression profile)：指通 过构建处于某一特定状态 下的细胞或组织 的非偏性 cDNA文库,大规模cDNA 测序,收集cDNA序列片段 、定性、定量分析其 mRNA群体组成,从而描绘 该特定细胞或组织 在特定 状态下的基因表达种类和 丰度信息,这样编 制成的 数据表就称为基因表达谱 表达谱测序表达谱测序 NlaIII限制性酶切 ChIP-sequencingChIP-sequencing MeDIP-sequencingMeDIP-sequencing Bisulfite Bisulfite SequencingSequencing 六、文库质量控制六、文库质量控制 基本指标 浓度 片段长度及均一度 纯度 评价方式 紫外分光光度计 微量定量：NanoDrop etc Agilent 耗材贵 Quantitative PCR Sequencing analysis Agilent 2100 Bioanalyzer 第二节第二节 测序模板制备技术介绍测序模板制备技术介绍 新一代高通量测序：单分子多拷单分子多拷 贝的获得贝的获得 l滚环复制 l乳液PCR l桥式PCR 单分子测序 一、滚环复制（一、滚环复制（rolling-circle amplificationrolling-circle amplification ） l技术起源 DNA复制的一种方式 l优点 恒温扩增 高灵敏 l应用：SNP，甲基化，生物芯片， WGA等 Complete GenomicsComplete GenomicsDNBDNB 2012年9月17日中国深圳的国际领先基因技术 公司深圳华大基因（华大基因）及人类全基因组 测序的创新领导者Complete Genomics, Inc.（ 纳斯达克：GNOM）（Complete），今日宣布 双方已经达成确定性协议，华大基因在美国的全 资子公司将向Complete发出现金收购要约，以 每股3.15美元（不计利息）收购该公司所有股权 。该提价较Complete于2012年6月4日最后的收 盘价2.04美元，高出54的溢价。6月4日是 Complete宣布开始考虑进行战略选择以确保继 续为其医疗技术的商业化提供所需资金来源之前 的最后一个交易日。 技术简介： 水包油：大部分化妆品 油包水 乳液聚合： 反应器 生化反应器 多重PCR反应 BEAMing（bead、emulsion、amplification、 magnetic） High-throughput Sequencing 二、乳液二、乳液PCRPCR 1 1、乳液、乳液PCR454 sequencingPCR454 sequencing 文库制备 乳液PCR 玻璃纤维上 进行固定 加入测序反 应需要的试 剂主要是酶 。 1平方毫米 的地方大概 有480个这 样的孔 Sequencing Workflow Sequencing Workflow Emulsion PCREmulsion PCR 8.0 h7.5 h4.5 hand 10.5 h DNA library preparation and titration emPCRSequencin g Emulsion-based clonal amplification Anneal sstDNA to an excess of DNA Capture Beads Emulsify beads and PCR reagents in water-in-oil microreactors Break microreacto rs, enrich for DNA- positive beads Clonal amplification occurs inside microreactors Sequencing WorkflowSequencing Workflow Loading of PicoTiterPlate DeviceLoading of PicoTiterPlate Device Well diameter: average of 44 m 400,000 reads obtained in parallel A single clonally amplified sstDNA bead is deposited per well Depositing DNA beads into the PicoTiterPlate device Quality filtered bases Amplified sstDNA library beads 2 2、乳液、乳液PCRSOLiDPCRSOLiD 乳液乳液PCRPCR SOLiDSOLiD Bead EnrichmentBead Enrichment Templated beads are separated from non-templated beads via polystyrene beads Pre- and Post-Bead Enrichment P2-Pre- and Post-Bead Enrichment P2- hybridizationhybridization Bead DepositionBead Deposition Templated beads are modified at their 3-end and covalently attached to a glass slide. Slide ConfigurationsSlide Configurations 三、桥式三、桥式PCRPCR（Bridge PCRBridge PCR） 固相PCR：是将特定的引物寡核苷酸通 过不同的方法共价固定在固相支持物上 来扩增目的DNA。 桥式固相扩增 桥式桥式PCRPCR（Bridge PCRBridge PCR） Illumina 高通量测序芯片表面连接有一层单链引物，两端 连接测序接头的单链DNA 片段通过与芯片表面的引物碱基 互补结合，引物延伸成为双链后，使双链变性成为单链， 该单链DNA 的一端就被“固定”在芯片上，而单链DNA 的另一端随机和附近的另外一个引物互补，也被“固定” 住，形成“桥（bridge）”。经过反复30 轮扩增后，每个 单分子得到了约1000 倍扩增，成为单克隆“DNA簇”。 桥式桥式PCR-SolexaPCR-Solexa Isothermal amplification Isothermal amplification method for method for next-generation next-generation sequencingsequencing Isothermal amplification method for Isothermal amplification method for next-generation sequencingnext-generation sequencing 四、测序模板的固定四、测序模板的固定 测序测序模板的固定模板的固定 Template immobilization a: emulsion PCR; b: composed two basic steps: priming and extending of the single- stranded single molecule template, bridge amplification occurred adjacent primers to form cluster; c: immobilization by a template; d: immobilization of a polymerase 目前高通量测样本制备中存在的目前高通量测样本制备中存在的 主要问题主要问题 样本文库制备 片段化 特定片段选择 文库预扩增等 测序模板准备 不同的制备方法（乳液，桥式） 扩增酶的特性 代表性降低！有效数据减少，甚至存在很 大偏差。 集成化，自动化，简单化能够较好的解决 并将成为主流方向 第三节第三节 测序样本准备测序样本准备 的自动化现状的自动化现状 一、样本核酸提取自动化设备一、样本核酸提取自动化设备 1 1、新一代的磁珠系统、新一代的磁珠系统Thermo Scientifi c KingFisher FlexThermo Scientifi c KingFisher Flex 在15-30min内纯化96个样品；通 过KingFisher系统的自动平行样品 处理，样品之间的交叉污染和试 剂浪费现象被有效消除； KingFisher Flex可与包括机械臂 (Robotics)，液体处理系统(Liquid Handling)等在内的自动化设备联 用，进一步增加KingFisher Flex的 处理通量，满足高通量实验的需 求。 KingFisherKingFisher技术技术 KingFisher系列产品是适于分离DNA/RNA、蛋白和细 胞的全自动提取纯化系统，专为解决客户现在和未来的所 有纯化问题而设计。创新的产品基于专利的KingFisher技 术(专利号US 6447729, US 6448092)，通过特制的磁棒吸 附、转移和释放磁珠，从而实现磁珠/样品的转移，避免 了液体处理过程，提高了自动化程度。KingFisher技术的 工作原理如下图所示，样品、溶液和磁珠置于微孔板或管 中，磁棒表面套有专门的磁套用于保护磁棒避免与样品/ 溶液/磁珠直接接触。 2 2、QIAGENQIAGEN的的QIAcubeQIAcube QIAcube：将离心柱的操作自动动化 QIAcubeQIAcube 二、安捷伦二、安捷伦 2200TapeStation2200TapeStation自动自动 化电泳系统化电泳系统 安捷伦科技公司今日发布了安捷伦 2200 TapeStation自动化电 泳系统，以实现新一代测序流程中样品和文库质量控制的自动化。 2200 TapeStation配合预包装的即用型 ScreenTape 试剂耗材， 能够简化和加快新一代测序工作流程中的质量控制。 安捷伦 2200 TapeStation 兼容 16 联条式样品卡和 96 孔板， 是一款能够快捷测定生物样品质量的台式自动化系统。客户只需简 单地将样品和 ScreenTape 消耗品载入一体式 2200 TapeStation 仪器中，每个样品仅需约 1 分钟即可轻松获得蛋白质、RNA 和 DNA 样品的完整分析结果。 安捷伦还提供业内一流的用于新一代测序的 SureSelect 靶向序 列捕获系统，它是溶液型杂交捕获技术，由安捷伦与麻省理工学院- 哈佛大学博德研究所最先研发成功。与安捷伦 2200 TapeStation 系统类似，SureSelect能够简化新一代测序的工作流程，便于研究 人员仅对感兴趣的基因组区域进行测序 安捷伦安捷伦 2200 TapeStation2200 TapeStation自动化电自动化电 泳泳系统系统 Agilent 2100 Bioanalyzer 样本核酸质控 片段选择纯化 测序文库质控 三、相关自三、相关自动动动动化化处处处处理模理模块块块块 1 1、TecanTecan Freedom EVOFreedom EVO（7575，100100，150150，200200） 实现 全自动Freedom EVP 150大型平台 的高通量方案(一次性处理1-96个样本)片断 化文库的制备工作。 T