《动物克隆》PPT课件.ppt

第三节 动物克隆 克隆(clone)是指通过无性繁殖的手段，从一个动物 细胞获得遗传背景相同的细胞群或个体群的过程。 获得的这些细胞叫克隆细胞，个体群称为克隆动物 (cloned animal)。 广义上的动物克隆就是指动物的无性繁殖(asexual reproduction)，即用无性繁殖的手段,由单一个体 产生外形、性能和基因型完全一致的多个动物。 1.1 克隆技术产生的历史背景 n1885年，Freiberg大学的动物学教授August Weismann 提出了一种新的遗传学理论，他设想受精卵分裂后的 每个子细胞只继承了母细胞一半的信息，以此来解释 为什么来源于一个受精卵的机体细胞会变成各种各样 的特化状态。 n胚胎学家William Roux宣布他用试验验证了Weismann 的遗传学理论。他用一个热针破坏掉2-细胞期青蛙胚 胎中的一个卵裂球，最后发育成一半的青蛙。 nHans Adolf Edward Dreisch企图在海胆上重复上述实 验时，却得到完全相反的结果。他把2-细胞胚的两个 卵裂球分开，结果分别发育成完整的海胆个体。 1 动物克隆发展简史 n1902年，德国胚胎学家Hans Spermann用头发将蜥蜴2-细 胞胚的两个卵裂球分开，得到与Dreisch相同的结果。 n结论：这一时期的每个胚细胞拥有完整的遗传信息，可以 产生完整的个体。 n 1902-1903年间，Walter Sutton在蝗虫等动物上的研究 发现，遗传信息的载体是染色体，染色体位于细胞核中， 它在生殖细胞分裂中的行为是随机的。这一发现在人类对 遗传现象的理解上具有里程碑的意义，也为孟德尔遗传定 律找到了理论解释。 1.2 克隆技术的创立 n1928年，Hans Spermann在蜥蜴上完成了人类历史上 第一次核移植实验。他首先用一根头发把一个新受 精卵勒住，将细胞核、细胞质各分一边，两部分之 间的没有任何交流。拥有核有一半继续分裂增殖， 等到16-细胞期时，松开头发套，让其中一个卵裂球 细胞的核流入另一侧细胞质中。最后再把这两部分 分开。结果发现，这个新建的细胞还能进一步发育 成胚胎。这说明早期胚胎卵裂球细胞中，仍拥有全 部的遗传信息，每个细胞都有指导发育成新个体的 潜能。 n1938年，Hans Spermann提出了克隆动物的设想：从一 个分化细胞中提取细胞核，然后注入另一个去核的受 精卵中构建新胚胎，他同时提出用体细胞进行动物克 隆的思想，但一直未能付诸实施。 n在此期间，1944年，Oswald Avery 在研究细菌转化现 象时，发现遗传信息存在于核酸中，而当时人们普遍 认为遗传信息存在于蛋白质上。这一发现对整个生物 科学，特别是细胞核移植研究产生了巨大影响。 1.3 与克隆技术有关的重大成果 n1952年，Robert Briggs和Thomas J.King用核移植方 法克隆出了北美豹蛙的蝌蚪。 n1953年，英国生物物理学家Francis Crick和美国生化 学家James Watson共同发现了DNA结构。 n1958年，Cornell大学生物学家F.E.Steward成功的用 一个胡萝卜细胞培育出了完整的植株。证明植物细胞 的全能性。 n1961年，Francis Crick和Sidney Brenner发现，每三 个核苷酸碱基序列组成一个密码，特异的针对一个氨 基酸。这一成果敲开了现代遗传学的开门。 n1962年，Oxford大学生物学家John Gurdon宣布用已完 全分化的南美青蛙蝌蚪的肠细胞核克隆出完整个体， 后来又从成年蛙的皮肤角质细胞克隆出了蝌蚪。 n1979年，德国生物学家Karl Illmensee宣布成功的克 隆出了3只小鼠。 n1984年，丹麦科学家Steen Willadsen成功的获得了第 一例胚细胞克隆绵羊。 n1986年，Wisconsin 大学的Neal First和Randal Prather等获得胚细胞克隆牛的成功。 n此后，胚细胞克隆兔（Stice,1988; 黄少华，1993； 王斌，1995），大鼠（Kono,1988），猪（ Prather,1989；赵浩斌，1997），山羊（张涌，1991 ），牛（李雪峰，1996），猴（Meng，1997）等相继 取得成功。 1991年，Westhusin等首先报道继代克隆胚胎可以正常发 育到囊胚。1993年，Stice和Keefer获得了第一、第二、 第三代继代克隆牛的出生。1995年，成勇等获得第二代克 隆山羊。1998年张涌等报道了第一至第五代克隆山羊的成 功。 1995年，Roslin Ian 研究所的Wilmut Keith和Campbell 用培养的胚盘细胞成功的克隆出了两只绵羊，表明已经有 组织分化的细胞仍具有发育的全能性。 1996年，Wilmut和Campell等成功地从培养的绵羊乳腺细 胞得到第一只成年体细胞克隆羊（Dolly）。随后几年间 ，体细胞克隆牛（Kono,1998;Wells,1999），小鼠（ Wakayama,1998）,猪（Onishi,2000），山羊（张涌等， 2000）等相继成功。 History of Nuclear Transfer Wakayama et al. 1998 Shin et al. 2002 Meng et al. 1997 Baguisi et al. 1999 goat Polejaeva et al. 2000 Chesne et al. 2002 供核动物 早期胚胎 分割胚 胚胎分割 胚胎干细胞 分离与克隆 胚胎干细 胞核移植 胚胎 干细胞 胚胎细胞核移植 胚胎 细胞 胎儿成纤维 细胞核移植 胎儿成纤维细胞 分离、传代培养 与诱导归零 体细胞分离、 传代培养与诱导归零 体细胞核移植 供卵动物 去核 去核卵母细胞 卵母细胞 重组胚胎体外培养 重组胚胎 核移植 图1 不同类型克隆动物制作技术路线示意图 克隆胚胎移植 胚胎移植 受体动物 克隆动物 2 动物克隆技术程序 n2.1 供核细胞的选择和处理 n2.1.1 胚胎卵裂球作为核供体 n原 理：早期胚胎卵裂球细胞是全能性的，是 一种未分化的细胞。 n面对问题：供核细胞如何选择？ n解决途径：一般选择桑椹胚前的细胞或后期胚胎 中的内细胞团(inner cell mass) n面对问题：如何协调卵母细胞质与植入的细胞核 之间的相互作用？ n解决途径：研究发现，与卵母细胞周期处于同一时期的 核能更好的实现再程序化(reprogramming)。早期胚胎的 卵裂球细胞可能处于各种时期，因此可用一些化学试剂 对胚胎细胞进行诱导，而使它们的周期同步化。 n方法一：M期同步法。常用噻氨酯达唑（nocodazole）、 乙酰甲基秋水仙碱（colcemid）。 n方法二：G1期同步法。阿菲迪霉素（aphidicolin）和羟 基脲(hydroxyurea)。可使胚胎细胞分裂停止在G1/S转折 期。 n方法三：G2期同步法。放线菌酮（cycloheximide，CHX ）、6-甲基氨基嘌呤（6-dimethylaaminopurine，DMAP ）。 2.1.2 胚胎干细胞作为核供体 n胚胎干细胞（embryonic stem cell, ES）来源 于早期胚胎内细胞团，具有与内细胞团细胞相 同的发育潜能和正常核型，又可以在体外增殖 。 n面对问题：ES细胞系的建立。 n研究现状：小鼠上已建立起ES细胞系，并有传 代至12代的仔鼠产生（Nagy,1993），但在家畜 上至今尚未有真正的ES细胞核移植体系建立。 在猪（Gerfen,1995）、绵羊（Wells,1995）、 牛(Saito,1992)及灵长类(Thopmsom，1995)上 已有ES样细胞系的建立。 2.1.3 体细胞作为核供体 n面对问题：供体细胞与受体细胞的周期同步化。 n对于给定的卵母细胞周期，只有处在正确周期状态的供体 细胞，才有可能进行发育。以常用的M期卵母细胞为例 ，如果将处于G1期供体细胞核进入其中后，在MPF作用下 ，发生核膜破裂（nuclear evenlop breakdown, NEBD） 、染色体超前浓缩（premature chromosome condensation，PCC）、核膜重新出现和类原核的形成（ pronulcear formation, PN）等现象。核重建后仍为2倍 体，能够进行正常的DNA合成及细胞分裂；如果移入的供 体细胞核处 于G2期，上述现象仍发生，但由于G2期核为4倍 体，因此无法正常发育；处于S期的供体细胞核进 入卵母细胞后，由于染色体倍型紊乱，也不能进 行后续的发育。 n解决途径：1.血清饥饿法。2.某些化学试剂处理 。如阿菲迪霉素（aphidicolin）、丁酸内酯- (butyrolactone-)。可以使大部分细胞阻滞 于G1/S期。 n影响因素：除了周期状态对供体细胞的核移植效 果影响外，源于同一原代细胞的亚克隆系细胞之 间，也因细胞基因的甲基化情况、乙酰化情况， 染色体的完整性，细胞周期等不同，重构胚的发 育能力也不同。另外，细胞类型不同，核移植成 功率也存在差异。 2.2 受体胞质的选择和处理 n2.2.1 卵母细胞在动物克隆中的作用 n在克隆中，供核细胞的全能性是基础，但这种全能性 只有在特定的条件下才能实现。这一特定条件就是卵 母细胞。研究发现：早期胚胎的发育首先是由母型信 息调控（maternal regulation）的，直到合子型基因 被激活，才能过渡到合子型调控（zogotic regulation）。也就是要经过由母源控制向合子型控 制胚胎发育的转变（maternal-zygotic transition, MZT）。 n2.2.2 卵母细胞的成熟及生物调控。 n卵母细胞中的RNA合成。 n卵母细胞中的蛋白质合成。 n卵母细胞成熟分裂能力的获得。 n卵母细胞成熟分裂的阻滞。 n卵母细胞成熟分裂的启动。 n卵母细胞成熟分裂的调控。 n2.2.3 胞质成熟 n在核成熟过程中，胞质中也发生一些非常重要的事件 ，以满足合子的正常发育，这一过程称之为胞质成熟 （cytoplasmic maturation）。包括蛋白质的合成及 磷酸化、能量代谢机制的发育和激活等。 n2.2.4 卵母细胞的体外培养 n2.2.4.1 卵母细胞的获取 n途径一：通过超数排卵收集活体动物的成熟 卵母细胞。 n途径二：通过体外成熟培养获得卵母细胞。 n2.2.4.2 卵母细胞成熟培养液 n常用的是TCM199+动物血清+FSH/LH+E2。随着 研究的深入，不断有新的改良方法出现。 n2.2.4.3 卵母细胞成熟的标志 n目前一般以排出第一极体作为卵母细胞成熟 的标志。 n2.2.5 卵母细胞的激活 n成熟后的卵母细胞停滞于M期，自然条件下， 当精子穿入（受精）后会激活卵母细胞，启动一 系列生化事件和形态变化。 n面对问题：核移植胚是怎样被激活的？ n解决途径： n途径一：电激活。电脉冲剌激是最经典、应用最 为广泛的卵母细胞激活方式。细胞膜在瞬间高压 电流脉冲的作用下，激发穿孔，从而使细胞内外 的离子和大分子物质发生短暂流动，其中钙离子 的内流会导致卵母细胞活化。 n途径二：化学物质激活。包括乙醇、钙离子载 体A23187（Calcium ionophore A23187, CaA） 、离子霉素（Ionomycin）、Sr2+、 Thimerosal(THI) 、Dithiothreitol(DTT)、三 磷酸肌醇、精子因子（sperm factor, SF）（ 精子的提取物）。 n2.2.6 卵母细胞去核 n卵母细胞去核成功与否是核移植的重要环节。 目前最常用的是通过显微操作去核，另外还有 化学试剂诱导去核法、高速离心去核法、紫外 线或激光照射使染色体失活去核法等。 n2.2.6.1 显微操作去核法 n方法一：McGrath法（1983）。具体过程是：先用细胞 松弛素B和/或秋水仙素处理卵母细胞（使细胞膜韧性增 强），然后将微吸管插入卵周隙中靠近第一极体的位置 ，连同第一极体一起吸除附近的部分细胞质。以后 Tsunoda(1988)采用荧光染料Hoechst33342先行染核， 在操作中或完成后可在荧光显微镜下检测去核效果，使 去核率大大提高。 n方法二：Willadsen法（1986）。具体过程为：先用玻 璃针在极体附近把透明带切一小口，再用钝端微细管吸 除约一半的细胞质，选用无核的一半作为核受体。 Dr. Karen Moore Using the lab micromanipulator Micromanipulator Used for enucleation and cloning n方法三：Oldenbourg(1996)法。原理是纺锤体 具有很强的双折射性，在偏振光下可以观察到 。因此，在显微镜中安装一个偏振光系统，然 后将所获得图像资料输入分析软件处理后，便 可在显示器上反映出M期染色体体所在位置 ，再行去核。 n方法四：末期去核法。先对卵母细胞激活，待 第二极体排出后，吸除第一极体及其附近10- 20%的胞质。 n2.2.6.2 化学试剂诱导法。卵母细胞激活处 理后孵育一段时间，在第二极体开始形成时， 再用含Demecolcine（脱羰秋水仙碱）的液体 孵育，可使大部分染色质随第二极体排出，达 到去核效果。 Nuclear Transfer Traditional Method The Piezo Method is an alternative. It requires lysis of the donor cell then recovery of nucleus for transfer to enucleated oocyte. 2.3 克隆胚的构建 n克隆胚胎的构建就是将供体细胞核和受体卵母细胞结 合形成新的胚胎的过程。目前常用的有电融合法和细 胞（核）直接注射法。 n2.3.1 电融合法 n原理：两种细胞的膜在一定强度的垂直电场作用下， 可以发生融合。 n操作步骤：将待融合的细胞置于含融合液的两个电极 之间，然后施以一定强度的脉冲剌激，细胞膜就可以 融合。 n影响融合率的因素：融合液、电场强度及脉冲时间。 2.4 核质互作与细胞核的再程序化 n2.3.2 细胞（核）直接注射法 n直接将供体细胞（核）注射进卵母细胞质即为直接 注射法。 n2.4.1 细胞核的再程序化 n供体细胞核进入卵母细胞后，核质之间相互作用而 发生一系列生化事件，供体细胞基因在结构和功能 上进行重塑，即再程序化（reprogramming），重 新启动分化发育的进程。 n细胞的再程序化主要表现在下列几个方面： nA核膜破裂、染色体凝集、原核形成：供体细胞 核进入激活前的卵母细胞（M）后，由于MPF的作 用，会发生NEBD、PCC及原核形成等现象。使用激 活的卵母细胞(后/末期)后，则没有PCC及核膨胀的 发生。 nB早期胚胎发育必需基因的表达：早期胚胎发育 时一些基因的表达是其进一步发育的基础。如Oct- 4,Fgf4,Rexl,Fgrf2等。 nC 能量代谢相关基因的表达：乳酸脱氢酸（LDH ）、三羧酸合成酶、磷酸果糖激酶（PFK）等是重 要的代谢酶，这些酶能否正确表达对核移植胚的正 常活动至