甜瓜属REMAP分子标记系统的建立和应用(中国科技论文在线).doc

中国科技论文在线甜瓜属REMAP分子标记系统的建立和应用基金项目：教育部高等学校博士学科点专项科研基金项目（20070307034；20090097110024）王东，江彪，娄群峰，陈劲枫作者简介：王东（1986-），男，硕士研究生，主要从事蔬菜作物遗传育种和生物技术方面研究通信联系人：陈劲枫（1956-），男，博士生导师，主要从事蔬菜育种与生物技术方面. E-mail: |1|王东|WANG Dong|作物遗传与种质创新国家重点实验室，农业部南方蔬菜遗传改良重点开放实验室，南京农业大学|State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Horticulture Department, Nanjing Agriculture University|王东（1986-），男，硕士研究生，主要从事蔬菜作物遗传育种和生物技术方面研究|南京农业大学园艺学院|210095|2009104059|(025)843962792|江彪|JIANG Biao|作物遗传与种质创新国家重点实验室，农业部南方蔬菜遗传改良重点开放实验室，南京农业大学|State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Horticulture Department, Nanjing Agriculture University|3|娄群峰|LOU Qunfeng|作物遗传与种质创新国家重点实验室，农业部南方蔬菜遗传改良重点开放实验室，南京农业大学|State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Horticulture Department, Nanjing Agriculture University|*|4|陈劲枫|CHEN Jinfeng|作物遗传与种质创新国家重点实验室，农业部南方蔬菜遗传改良重点开放实验室，南京农业大学|State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Horticulture Department, Nanjing Agriculture University|陈劲枫（1956-），男，博士生导师，主要从事蔬菜育种与生物技术方面|南京农业大学|210095||(025)84396279瓜属REMAP分子标记系统的建立和应用|The Development and Application of REMAP Molecular Marker Technique in Cucumis|教育部高等学校博士学科点专项科研基金项目（20070307034；20090097110024）- 9 -（作物遗传与种质创新国家重点实验室，农业部南方蔬菜遗传改良重点开放实验室，南京农业大学）摘要：基于甜瓜属Ty1-copia类逆转座子的长末端重复序列信息，结合ISSR引物序列，在体系优化的基础上，建立了适用于甜瓜属物种的REMAP(Retrotransposon-microsatellite Amplified Polymorphism)标记系统。进一步对46份甜瓜属不同生态型材料进行聚类分析，发现该标记系统能有效检测甜瓜属不同类型材料间的多态性，说明该REMAP标记系统可成为甜瓜属品种鉴定及指纹图谱构建的新方法。关键词： 甜瓜属；分子标记；REMAP；多态性中图分类号：S63The Development and Application of REMAP Molecular Marker Technique in CucumisWANG Dong, JIANG Biao, LOU Qunfeng, CHEN Jinfeng(State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Horticulture Department, Nanjing Agriculture University)Abstract: REMAP (retrotransposon-microsatellite amplified polymorphism) marker system was developed based on the long terminal repeat (LTR) sequence of Ty1-copia retrotransposon in Cucumis, and combined with the primers of ISSR. It was employed for phylogenetic analysis with 46 different materials in Cucumis. The results indicated that this new marker system can detect polymorphism among different material, and can be used for variety identification and fingerprint.Key words: Cucumis; molecular marker; REMAP; Polymorphism0 引言逆转座子（Retrotransposon）是高等植物中种类最多、分布最广的一类可移动因子。逆转座子贯穿植物整个生命过程，并且是构成植物基因组的主要成分。其转座过程以RNA为中间媒介，通过逆转录酶所主导的DNA-RNA-DNA方式转座，每转座一次，其拷贝数就增加一次，从而成为植物基因组的重要组成部分1。根据是否具有长末端重复序列LTR（long terminal repeat）。可将其分为LTR和非LTR两类1-2。目前研究较多的是LTR类逆转座子，是一类异质性很高的群体，以高拷贝数形式出现，广泛存在于常染色体中，在植物中表现插入多态性3。逆转座子的广泛分布、高度异质及拷贝数多等特性使其成为研究植物遗传多样性和进化的理想工具。REMAP（(Retrotransposon-microsatellite amplified polymorphism)）是其基于逆转座子长末端重复序列并结合ISSR开发的应用比较广泛的标记系统之一。已有研究表明REMAP标记系统具有谱带丰富、多态性高，以及操作简便等优点4，在品种鉴定和遗传多样性分析方面具有广泛的应用价值5。甜瓜属包括甜瓜（Cucumis melo L.）和黄瓜（C. sativus L.）两种重要作物，但其遗传基础狭窄，黄瓜栽培种间的多态性仅为3%-9%，进一步开发多种分子标记系统对于促进甜瓜属植物基因组研究具有重要的意义。我们的前期研究发现逆转座子在黄瓜的基因组中分布广泛6，基于逆转座子的标记系统将能有效地进行黄瓜遗传多样性的分析。我们还基于逆转座子开发了SSAP标记7。虽然SSAP标记能够有效地用于揭示甜瓜属不同材料间的遗传多样性，但是该标记系统基于酶切和PCR技术，对DNA质量要求较高，操作步骤繁多，在一定程度上限制了其应用。因此，基于逆转座子在甜瓜属作物中的广泛分布特点，进一步开发多态性高、操作简单，基于逆转座子的标记系统在黄瓜这样遗传基础狭窄的作物中具有重要的意义。本文根据黄瓜中Ty1-copia类逆转座子的LTR序列，首次开发建立了适于甜瓜属的REMAP标记系统，并用于甜瓜属品种间的多样性分析。1 材料与方法1.1 材料以本实验室从国内外收集到的46份甜瓜属材料。23份黄瓜材料和23份甜瓜收集于中国南北方以及各大洲多个国家，包括各个基因型。名称及来源见表1。表1 用于REMAP标记系统所使用的甜瓜属材料Tab. 1 The materials in Cucumis used for REMAP编号品种类型（来源）染色体数目编号品种类型（来源）染色体数目1EC1欧洲温室型黄瓜2n=2x=1424PI436533塞内加尔甜瓜2n=2x=242EC2欧洲盐渍型黄瓜2n=2x=1425PI136170意大利甜瓜2n=2x=243Hazerd欧洲温室型黄瓜2n=2x=1426PI136229加拿大甜瓜2n=2x=244Beit Alpha美国生态型黄瓜2n=2x=1427PI295431澳大利亚甜瓜2n=2x=245Marketmore 97美国生态型黄瓜2n=2x=1428PI323498中国甜瓜2n=2x=2465211种间渐渗系黄瓜2n=2x=1429PI157071中国甜瓜2n=2x=2477011A美国生态型黄瓜2n=2x=1430AMES2829美国甜瓜2n=2x=248PI483342美国生态型黄瓜2n=2x=1431PI525135埃及甜瓜2n=2x=249PI508454美国生态型黄瓜2n=2x=1432PI525141埃及甜瓜2n=2x=2410PI508455美国生态型黄瓜2n=2x=1433PI500362赞比亚甜瓜2n=2x=2411PO2华北生态型黄瓜2n=2x=1434PI5O5601赞比亚甜瓜2n=2x=2412PO1华北型黄瓜2n=2x=1435PI525115埃及甜瓜2n=2x=2413PO3华北型黄瓜2n=2x=1436PI249897赞比亚甜瓜2n=2x=2414CC1华北型黄瓜2n=2x=1437PI196477巴西甜瓜2n=2x=2415CC3华北型黄瓜2n=2x=1438PI185111加纳甜瓜2n=2x=2416平望华南型黄瓜2n=2x=1439PI299568南非甜瓜2n=2x=2417SWCC8西双版纳黄瓜2n=2x=1440PI292190南非甜瓜2n=2x=2418SWCC9西双版纳黄瓜2n=2x=1441PI374152南非甜瓜2n=2x=2419SWCC10西双版纳黄瓜2n=2x=1442PI324525阿富汗甜瓜2n=2x=2420SWCC12西双版纳黄瓜2n=2x=1443PI476332俄罗斯甜瓜2n=2x=2421二早子华南型黄瓜2n=2x=1444PI489689墨西哥甜瓜2n=2x=2422C. hystrix黄瓜近缘野生种2n=2x=2445PI507873匈牙利甜瓜2n=2x=2423C. hytivus黄瓜种间杂交种2n=4x=3846AMES2830美国甜瓜2n=2x=241.2 方法1.2.1 基因组DNA提取供试植株于温室中统一播种，待植株长至第5片真叶时，取刚展开的新叶，采用CTAB法8提取基因组DNA，利用琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭显色进行DNA浓度的定量。1.2.2 REMAP引物的设计与合成REMAP标记系统的引物正反向引物分别来源于Ty1-copia类逆转座子的LTR区和ISSR标记，其中Ty1-copia类逆转座子序列信息来源于GenBank，登陆号为GQ326556，引物序列信息见表2。引物由上海英骏生物有限公司合成。表2 甜瓜属REMAP引物Tab. 2 the primers used in this study序列来源引物名称序列退火温度Ty1-copiaLTRATCGCTGAAGTGAATGGTGGTC55Ty1-copiaLTRZISSRJ1ACACACACACACACACGC1.2.3 REMAP反应程序的建立调整反应体系中DNA模板量、Taq酶、Mg2+、dNTP和引物等各成分的比例，优化扩增体系。PCR扩增反应在PTC-100 PCR仪上进行，扩增程序为：94预变性5min，94变性30s，50退火30s，72延伸2min，40个循环；循环结束后72延伸10min，4终止反应。1.2.4 PCR产物检测1L上样缓冲液与6L PCR产物混合后，在2%琼脂糖凝胶上以1TAE缓冲液进行电泳，EB染色，在凝胶成像系统中采集图像。1L上样缓冲液和3LPCR产物混匀后，6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染检测。1.2.5 聚类分析 每对REMAP引物检测，视每条多态性条带为一个数据统计条带，采用1（有）和0（无）的方法统计条带，用NTSYSpc2.11软件进行分析作图。2 结果与分析2.1 REMAP标记技术的建立采用CTAB法提取黄瓜基因组DNA，通过调整DNA模板量、Taq酶、Mg2+、dNTP和引物的比例，确定REMAP标记的反应体系为：1buffer，2mmol/L Mg2+，0.2 mmol/L dNTP，Taq酶1 U，6pmol引物，模板DNA 50ng，以ddH2O补足20微升。2.2 2%琼脂糖凝胶电泳检测结果100bp250bp500bp750bp1000bpp2000bpppM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 100bp250bp500bp750bp1000bp2000bp M 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 图1甜瓜属46份不同生态型材料REMAP标记检测结果Fig. 1 REMAP prole of DNA from 46 different materials in Cucumis.图1为甜瓜属46份不同生态型材料的REMAP标记产物的琼脂糖凝胶电泳结果。黄瓜共出现7条多态性条带，条带集中在100bp-750bp之间。在250bp-750bp之间有5条共有条带，差异率为28.6%。黄瓜各个材料均得到5-6条条带。在23份甜瓜材料中共扩增得到8条多态性条带，条带集中在100bp-500bp间有3条共有带型，差异率表现为62.5%。2.3 REMAP琼脂糖凝胶电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳比较1000bp2000bpM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 750bp500bp250bp 100bp图2 REMAP聚丙烯酰胺凝胶电泳检测46份甜瓜属材料结果Fig. 2 REMAP prole of DNA from 46 different materials in Cucumis.图2 REMAP检测结果中，共呈现出33条不同带型，明显多于琼脂糖凝胶电泳检测出的条带数。例如在甜瓜材料中，琼脂糖凝胶电泳结果中只有8个条带。而在聚丙烯酰胺凝胶电泳中则出现31个。在100bp-250bp间显现出21种带型，在琼脂糖凝胶电泳中只有4条带。表明REMAP标记扩增中，产生大量大小相近条带以及弱带，这对于分辨率较低的琼脂糖凝胶电泳而言，很难得到清晰详尽的指纹图谱。琼脂糖胶电泳适合一般核酸检测，但相对于REMAP，扩增条带较多，则需要分辨率高的电泳。由此可见，为了得到更加准确的指纹图谱，6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳应优先选择，这也与王利英等9的分析结果一致。由此可见，本试验建立的甜瓜属REMAP标记技术能有效地应用于甜瓜属不同材料间的指纹图谱构建及品种鉴定。同时说明Ty1-copia类逆转座子广泛存在于甜瓜属，拷贝数较多，且具有高度的异质性。2.4 REMAP与ISSR单引物扩增结果比较分析图3 ISSR单引物扩增46份甜瓜属材料结果Fig. 3 ISSR prole of DNA from 46 different materials in Cucumis.由于REMAP标记引物是基于LTR的引物与ISSR引物的组合，产生的条带有可能仅为ISSR引物的扩增产物，为了确定REMAP标记产生的条带是来源于两引物组合的结果，我们进行了ISSR单引物扩增。结果表明，单ISSR引物扩增结果与REMAP标记的扩增产物差别较大。在黄瓜材料中仅有四条，仅仅只能把材料14，15和20区分开来，其余黄瓜材料均为在1000bp-2000bp和100bp-250bp之间两条共有条带。甜瓜材料中共出现7条多态性条带，远远低于REMAP标记的33条多态性条带（图2）。由此说明，REMAP标记扩增的条带，绝大多数为逆转座子与ISSR引物共同作用结果，表现为反转录转座子与简单重复序列之间的多态性条带。2.5 基于REMAP标记的甜瓜属材料的聚类分析图4 基于REMAP标记的甜瓜属46份材料聚类分析Fig.4 The genetic relationship of 46 different materials in Cucumis based on REMAP根据REMAP分子标记检测结果进行统计分析，利用NTSYSpc2.11获得甜瓜属46份材料的遗传图谱。46份材料被分为两个类群。类群一又分为5个亚类，在类群一里，绝大多数为黄瓜品种，基于REMAP分子标记能够把遗传距离狭窄的黄瓜各个品种区分开来。类群二中分析了甜瓜品种的遗传差异.各个甜瓜品种分为7个亚类，相互间遗传距离较远，可以清晰的分辨出甜瓜各个品种。可见，REMAP标记检测结果其较高的多态性，可以成为品种间遗传差异分析的重要工具。3 结论本文根据Ty1-copia类逆转座子的LTR序列设计引物，与ISSR引物配对组合成REMAP分子标记，应用于甜瓜属46份材料，建立了适合于甜瓜属材料的REMAP分子标记系统。通过与ISSR单引物的扩增结果比较，阐明了REMAP扩增图谱的来源是逆转座子和ISSR引物共同作用结果，并根据不同检测方式的比较，认为高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳应优先选择。并进而对检测结果的聚类分析，揭示了REMAP 的实用性。逆转座子标记较常规标记具有灵敏度高、基因组覆盖度广和多态性丰富等特点，尤其适用于种质鉴定、遗传多样性及系统发育分析10。REMAP标记系统由基于逆转座子与微卫星序列间序列而建立。其原理是根据反转录转座子的LTR保守序列和ISSR序列设计引物然后进行PCR，扩增出反转录转座子与最接近的ISSR间的片段，从而检测反转录转座子与简单重复序列之间的多态性。REMAP一个重要的优势就是能够跟踪逆转座子的插入事件及在一个家系中的垂直辐射度，因此，REMAP的多态性能够在遗传同源的材料各个世代中用来检测和定位逆转座子的活动及插入11。目前，基于逆转座子的标记系统REMAP已广泛用于大麦12、柑桔13、网茅14等植物的遗传研究中。郭大龙等15利用IRAP和REMAP技术分析了部分柿属植物的亲缘关系。Manninen等16用逆转座子标记REMAP和IRAP定位大麦网斑病抗性基因，将该基因定位于染色体6H上。甜瓜属植物尤其是黄瓜遗传基础非常狭窄，急需多种标记系统以促进其遗传多样性和基因组学研究。本文根据Ty1-copia类逆转座子的LTR序列设计引物，结合ISSR引物，成功开发了REMAP标记系统，并应用于甜瓜属不同生态型材料中。通过与ISSR单引物的扩增结果比较，阐明了REMAP扩增图谱的主要来源是逆转座子和ISSR引物共同作用结果，并根据不同检测方式的比较，表明高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳扩增效果更好。进而对检测结果进行聚类分析，揭示了REMAP标记系统的实用性。本试验建立的甜瓜属REMAP分子标记技术体系，对进一步开展甜瓜属相关分子生物学研究，如建立高密度遗传图谱、重要目标性状定位、生物多样性与系统进化研究等具有重要的意义。 参考文献 (References) 1 Kumar A, Bennetzen JL. 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