油菜花粉粒萌发的荧光观察毕业论.docVIP

安庆师范学院生命科学系毕业论文题 目 油菜花粉粒萌发的荧光观察 指导教师 龚 莉 届 别 2009 届 学 号 2305107 姓 名 施 晓 丽 油菜花粉粒萌发的荧光观察施晓丽 指导老师：龚莉 (安庆师范学院生命科学系 安徽 安庆 246011) 摘要：研究目的：油菜是我国人民食用油的主要来源作物之一，在我国经济作物中具有重要作用。多年来，科学工作者们通过杂交育种的方法获得了许多优质高产的油菜新品种。为弥补以往观察方法的不足，本研究试图通过对甘蓝油菜的种内自花授粉，不同油菜品种的种间异花授粉这两组试验进行荧光显微技术观察，详细了解花粉粒在花粉管中的萌发过程，从细胞水平探讨种内、种间杂交的亲和性程度，从而为花粉粒的细胞水平研究提供一些理论参考。研究方法：采用荧光显微镜技术，观察自花授粉、异花授粉下花粉粒的萌发生长情况。研究结果：油菜自花、异花授粉的花粉均能够大量萌发，表现出高度的亲和性。关键词：油菜；花粉粒；荧光观察1 引言油菜是十字花科植物，原产我国，南北广为栽培，四季均有供产。同时也是我国人民食用油的主要来源作物之一，可以说油菜在我国的经济作物中具有重要的作用。多年来，人们通过杂交育种方法获得了许多优质高产的油菜新品种。但并不是所有的花粉粒在柱头上都能萌发，不能萌发的主要原因有：一、花粉在柱头上不萌发或花粉管不能进入柱头；二、少量的花粉管进入柱头，但伸长受阻，多数不能到达胚囊受精；三、配子不融合或受精卵不能发育成完整的胚，因而出现相当多的无胚或胚发育不完全的种子。对于这些原因科学工作者们做了许多的研究。植物开花传粉后,落在柱头上的花粉粒经识别,亲和的则吸收柱头上的水分和分泌物开始萌发,内壁从萌发孔突出,继续伸长,形成花粉管。为观察花粉粒的萌发,现在植物学实验多数是采集花粉粒,在含有蔗糖、硼酸、琼脂的培养基上培养几十分钟,使其萌发,然后制片置于显微镜下观察。此方法花粉粒的萌发是人工培养的,不能显示其在花柱上的实际萌发情况。花粉粒在柱头上萌发及在花柱中伸长的真实情况,一般采用石蜡切片观察,这种方法费时、费工,效果不好。而利用荧光染料及荧光显微镜可弥补上面两种方法的不足,操作简单,效果显著。罗坤8对植物花粉粒的研究。此次研究观察了不同植物花粉粒的产生、形态及其发育阶段，为花粉的应用，例如植物分类学、地质学中油的勘测、考古工作、植物培育试验、医学等各方面都提供了重要信息；肖朋，常桂菊，王保仁1以甘蓝型油菜为母本、白菜型油菜和芥菜型油菜为父本进行种间杂交，用扫描电镜和荧光显微镜对异源花粉在柱头上萌发及其花粉管进入柱头进行观察，他们的试验结果表明：花粉管生长表现出几种异常形态，即花粉管短，顶端球状膨大和棒状膨大、分叉，花粉管细长、均匀或不均匀扭曲。从而探讨了异源花粉不能进入柱头的机理，为解决种间或远缘杂交不亲和性及其应用提供了重要参考。同时在这些研究中做出贡献的还有：魏建和，马风杰，黄璐琦等4采用荧光显微技术观察桔梗花粉管的萌发，确认了桔梗自交亲和性及萌发部位，从微观角度提供了桔梗自交亲和的证据；陈彦，周坚5用脱色苯胺蓝对紫薇花粉和花粉管进行染色，在荧光显微镜下观察其自然条件下的受粉习性及花粉管生长行为，确定其受精时间，为外源DNA的导入奠定了基础，从而提高了转化率；葛宇，许明，石研7以白萝卜为实验材料，从细胞显微结构水平，分别利用荧光显微镜法和电子显微镜法观察花粉在柱头上的萌发情况和花粉管在花柱组织中的生长状况，判断各柱系的自交不亲和程度，为育种工作提供了理论依据。由此可见，对植物花粉的研究在杂交育种方面具有重要作用，在这些研究中，为了克服在普通光学显微镜下只能观察到柱头表面花粉管的萌发，而看不到柱头内部的生长过程的缺点，科学研究者们都采用了荧光显微技术。其实，早在1993年刘国成9就采用了荧光诱导方法对山楂花粉管的发育过程进行了观察。在本次的研究中我们也将采取荧光显微技术对油菜花粉粒的萌发进行观察。本研究采用荧光显微技术，主要以甘蓝型油菜为试验材料，通过甘蓝油菜的种内自花授粉，不同油菜品种的异花授粉这两组不同试验的荧光观察，详细了解油菜花粉粒萌发的过程，从细胞水平探讨种内、种间及远缘杂交的亲和性程度，从而为花粉粒的细胞水平研究提供一些理论参考。2 材料和方法2.1 材料试验材料为安庆师范学院生命科系植物园中种植的垦C1和7H321号油菜植株及其花粉。于2009年3月19日进行人工授粉处理，取样，固定。2.2 人工授粉取样授粉分为人工自花授粉和异花授粉。2009年3月19日上午8：009：00，选取还未散粉的花蕾先进行去雄套袋，将取下的花粉置于培养皿中保存。于当日上午9：0010:00对雌蕊柱头进行人工授粉。授粉后2，4，6，8，24小时分别采摘4朵花，取雌蕊放入卡诺氏固定液中固定4小时以上（固定液冰乙酸：无水乙醇=1：3），然后置于70%乙醇中保存，待用。2.3 花粉粒萌发的观察方法采用荧光显微镜法观察花粉粒的萌发。具体流程如下：取保存的雌蕊，用蒸馏水冲洗干净，置于载玻片上，在载玻片上将油菜花柱用刀片纵切成薄片,用吖啶橙染液染色10分钟，然后盖上盖玻片，均匀用力压片，在荧光显微镜下观察并拍照。3 结果与分析 3.1 花粉和柱头的形态特征甘蓝型油菜花粉粒赤道面观近圆形或长圆形，极面为三裂圆形，花粉具三个萌发沟，沟较宽，长达近两极，末端稍尖，沟上覆盖有颗粒状物。外壁具明显的网状雕纹。网眼形状不规则，大小不一(图1，2，7，8)，甘蓝型油菜柱头主要由众多的乳突组成，极面呈圆形或长圆形，中间有一条深深下陷的短沟。乳突呈长圆柱形，顶端钝圆(图1,6)。初期乳突生长较短，排列紧密，随着柱头的成熟逐渐伸长，基部膨大，相邻乳突的空间间隔也相应增大。为花粉附着及萌发提供了适宜的场地和条件 。3.2 自花授粉的花粉在柱头上的萌发在甘甘杂交组合中，授粉4小时种内杂交的组合，其花粉已大量萌发，在8小时以后花粉管开始伸长，24小时后全部萌发。由此可见油菜自花授粉亲和度高。但是在种内杂交中，发现有一小部分甘蓝型油菜柱头上萌发的花粉粒不能进入柱头，通过观察发现此时的花粉柱头没有开裂，花粉管也没有伸长。3.3 异花授粉的花粉在柱头上的萌发在种间杂交组合中，授粉2小时以后，柱头上的花粉已有部分开始萌发，花粉粒的三个萌发孔清晰可见，8小时以后花粉管开始伸长，24小时后全部萌发。由此可见油菜异花授粉亲和度高。但也发现了少数在自花授粉中出现的情况：少数花粉粒不能萌发。通过观察也发现花粉柱头没有开裂，花粉管没有伸长。3.4 花粉管与乳突细胞的相互作用据荧光显微镜的观察，在异花授粉的乳突表面上，可清晰看到与花粉管接触处，乳突细胞表面出现绉缩、松弛以及“腐蚀”斑点。综合我们的荧光观察，我们认为花粉管应该是通过溶解乳突细胞壁(纤维素果胶层)而进入到柱头，有生活力的花粉粒长出的花粉管在花柱中伸长,发出黄绿色荧光,清晰可见,且各花粉管在花柱中生长的长度参差不齐，而没有生活力未萌发的花粉粒及花柱的其他组织没有荧光。图2 油菜花粉粒萌发的荧光观察异花授粉 2小时 40*10 萌发中的花粉粒图1 油菜花粉粒萌发的荧光观察异花授粉2小时 20 *10花粉粒和乳突细胞 图4 油菜花粉粒萌发的荧光观察自花授粉 4小时 20*10图3 油菜花粉粒萌发的荧光观察异花授粉 8小时 10*10图6 油菜花粉粒萌发的荧光观察异花授粉 乳突细胞 2小时 40*10图5 油菜花粉粒萌发的荧光观察自花授粉 2小时 10*10图8 油菜花粉粒萌发的荧光观察自花授粉 4小时 20*10图7 油菜花粉粒萌发的荧光观察异花授粉 4小时 20*104 小结与讨论本研究利用荧光显微镜技术，同步观察了油菜自花、异花花粉授粉后在柱头上的萌发生长情况，由于试验中没有等去雄的雌蕊柱头全部开裂就进行了人工授精，致使试验过程中观察到一小部分的未萌发花粉。为能更好地证明油菜花粉自交的高度亲和性，本试验还有待改进，例如：在人工去雄套袋后不要立即进行试验，等雌蕊柱头全部开裂后再进行人工授精，或者将试验分成两组，一组雌蕊柱头全部开裂后授精，另一组雌蕊柱头没有开裂时授精，由此对比最终的试验结果。 其次，在本次试验过程中观察和拍摄到的花粉管在柱头中萌发的照片很少，成为了本次试验的重大遗憾。分析原因，可能由于投手切片技术不够熟练，切片较厚，使压片不够均匀，影响到观察结果；也可能由于授精后取材时间比较偏早，致使很难观察到花粉管在柱头中伸长的过程。采用荧光显微镜技术，在WU激发下花粉发出黄绿色荧光，能够清晰的看见花粉粒的三个萌发孔，花粉管在花柱内穿行时产生大量的胼胝质，产生强烈的荧光，因此，采用荧光显微镜法能快速测定植物授粉的亲和性，可以弥补以往传统试验的不足。致谢: 本论文是在龚莉老师的悉心指导下，由本人独立完成。在此过程中还得到许远老师的指导及丁小凤同学的帮助，在此特表示衷心感谢。参考文献1 肖朋，常桂菊，王保仁.油菜异源花粉在柱头上萌发过程观察J.中国油料，1995，（2）.2 孟金陵.甘蓝型油菜与近缘种、属杂交时花粉-雌蕊相互作用的研究J.作为学报，1990，（16）.3 曾佩玲.油梨的花药发育和花粉粒形成J.广西热作科技，1998，（2）.4 魏建和，马风杰，黄璐琦，等.桔梗花粉管萌发的荧光显微观察J.中国中药杂志，2007，（16）.5 陈彦，周坚。紫薇花粉习性及花粉管生长的研究J.聊城大学学报，2006，（2）.6 胡适宜.检查花粉在柱头上萌发和花粉管在花柱中生长的制片法J.植物学通报，1994，（11）.7 葛宇，许明，石研.白萝卜自交不亲和性显微结构观察.研究报告，2007.8 罗坤.花粉的结构和发育J.蜜蜂杂志，2000，（11）.9 刘国成.山楂花粉管发育过程的荧光观察方法J.北方果树，1993，（2）.10 贺晃，王晓玲，符儒民，等.海南普通野生稻的花粉育性观察及杂交亲和性J.热带作物学报，2007，（3）. 11 杨广烈. 荧光与荧光显微镜J;.光学仪器, 2001年,(2).12 张秀省，黄勇，蔡连捷. 利用荧光显微镜观察油菜花粉粒的萌发.生物学通报，2002，（2）.The rape pollen grain sprouts the fluorescence observesShi XiaoLi Teacher:Gong Li(Department of Biology Anqing Teachers College AnhuiAnqing 246011)Abstract: Research goal: The rape is one of our country people cooking oil main origin crops, is one of our country important industrial crops, for many years, the scientific workers have obtained many good quality and high output rape new varieties through the crossbreeding method.This research attempts through a sea cabbage rapes kind of in self-pollination, the different rape variety cross-pollination these two group of different experiment fluorescence observation, in understood in detail the pollen grain in the pollen tube germination process, plants, the inter-species hybridization endophilicity degree from the cell level discussion, thus provides some theory reference for the pollen grain cell level research.Research technique: Uses the fluorescence microscope technology, observes from under the flowered pollination, th