实验三基因的PCR扩增技术.ppt

实验三 基因的PCR扩扩增技术术 一、实验目的 v学习PCR反应的基本原理与实验技术 v从BCG基因组组DNA中PCR扩扩增Rv1791（ PE19）基因 二、基本原理 vPCR类似于DNA的天然复制过程。 v将待扩增的DNA片段与其两侧互补的两段寡核苷酸 引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩 增倍数可达2n倍。 体内体内DNADNA的复制的复制 DNADNA聚合酶聚合酶 dNTP dNTP 解旋酶类解旋酶类 引物引物 5 5 3 3 加热加热 变变 性性 复复 性性 复 温 DNADNA的变性和复性的变性和复性 加热或强酸、碱性作用加热或强酸、碱性作用 可以使可以使 DNADNA双螺旋的氢双螺旋的氢 键断裂键断裂, ,双链解离双链解离, ,形成形成 单链单链DNA,DNA,这称为这称为 DNADNA的的 变性。变性。 解除变性的条件后解除变性的条件后, , 变变 性的单链可以重新结合性的单链可以重新结合 起来起来, ,形成双链形成双链, ,其原有其原有 的特性和活性可以恢复的特性和活性可以恢复, , 这称这称DNADNA复性复性, , 也叫退火也叫退火 。 PCRPCR扩增原理扩增原理 引物引物 延伸延伸 延伸延伸 5 5 5 5 3 3 3 3 变性、退火变性、退火 变性、退火变性、退火 总体积总体积 25-100 25-100 l l Buffer Buffer 缓冲液缓冲液 dNTP dNTP 原料原料 Primer Primer 引物引物 DNADNA分子分子 模板模板 TaqTaq酶酶 DNADNA聚合酶聚合酶 1 1 反应体系反应体系 三、实验材料 vBCG基因组组DNA v10PCR反应缓冲液、4dNTPs、Taq DNA聚合酶 、模板DNA、引物 （P1、P2）、超纯水SW vPCR反应管、移液器、 PCR仪、离心机 四、实验步骤 v引物设计 v准备PCR反应溶液 vPCR扩增反应 v结果检测 vRv1791-F： ATGAATTCAGGAAGACAGCATGTCGTTC（ EcoR I） vRv1791-R： vATCTCGAGTGTTCCCCCTCTCCTTCAG v（XhoI） （二）准备PCR反应溶液 10PCR反应缓冲液 2.5l 4dNTPs 2.0l 引物P1 1l（10nM） 引物P2 1l 模板DNA 2l Taq DNA聚合酶 0.2l 用无菌去离子水至 25l 用手指轻弹PCR反应管管底部，使溶液混匀 在台式离心机中离心2秒以集中溶液于管底 在PCR仪中设计如下反应程序：94C、5min；94C、30sec， 61C、40sec，72C、30sec，30个循环；72C、5min （三）PCR扩增反应 将已混匀的PCR反应管置于PCR仪 的反应孔中，盖好盖子 进行反应。反应完毕，将样品取出 置于冰浴中待用 （四）结果检测 v本PCR扩增的产物DNA片段长度为300bp，适合于 在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳检测。从每个反应管 中取5ul PCR产物进行电泳检测。 12345 循环 94 30s 56.5 40s 72 60s 94 30s 57.7 40s 72 60 94 30s 58.6 40s 7