RFLP限制性片段长度多态性.ppt

限制性片段长度多态性 RFLP 08生物科学 马静怡 王朋飞 王永涛 08生化与分子生物学 刘天资 Your company slogan LOGO 限制性片段长度多态性RFLP 1 RFLP技术的简介 2 RFLP中应用的限制性内切酶 3 RFLP的实验步骤 4 RFLP技术的应用 Your company slogan LOGO 分子标记的历史分子标记的历史 v 第一代分子标记技术 RFLP （Restriction Fragment Length Polymorphism ，限制性片段长度多态性） v 第二代分子标记技术 RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，随机 扩增多态性DNA ） AFLP （Amplified Fragment Length Polymorphism ，扩增片断长度多态性） v 事实上，还有很多分子标记技术像SSR、ISSR、SRAP（ 相关序列扩增多态性）另外，还有现在号称为第三代分子 标记的SNP（ 单核苷酸多态性) Your company slogan LOGO RPLF RPLF技术的简介技术的简介 v 个体差异差异大多数都是由于不编码蛋白质的区域和没有 重要调节功能的区域发生中立突变。这些突变构成的差异 成为DNA多态性。 v 假如DNA 顺序中的某个碱基发生了突变，使突变所在部 位的DNA 序列产生（或缺失）某种限制性内切酶的位点 。这样，利用该限制性内切酶消化此DNA 时，便会产生 与正常不同的限制性片段。在同种生物的不同个体中会出 现不同长度的限制性片段类型，即限制性片段多态性（ Restriction Fragment Length Polymorphism ， RFLP ）。 v RFLP作为一种“遗传路标”，对人类基因组制图提供必要 的标记，当多态性顺序与人类遗传性疾病位点连锁时，可 作为遗传缺陷的产前诊断或是鉴别携带者的标记，还可以 应用于亲子鉴定和群体研究等方面。 Your company slogan LOGO RPLF RPLF技术的原理技术的原理 v 利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因 组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目 和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布 情况。 v 通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆 DNA探针进行Southern杂交和放射显影，即获得反映个 体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制 性内切酶消化后产生片段在长度上差异。 v 由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等 变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型 间限制性片段长度的差异。 Your company slogan LOGO RFLP的类型 v 1.点的多态性 表现为DNA链中发生单个碱基的突变，且突变导致一个原有 酶切位点的丢失或形成一个新的酶切位点。Southern杂交 即可诊断。 v 2.序列多态性 由于DNA 顺序上发生突变如缺失、重复、插入所致。 由于高变区（highly variable region ）内串联重复顺序 的拷贝数不同所产生的，其突出特征是限制性内切酶识别 位点本身的碱基没有发生改变，改变的只是它在基因组中 的相对位置。 Your company slogan LOGO RFLP中应用的限制性内切酶 v 限制性内切酶（restriction endonuclease）是一类具有 特殊功能的核酸切割酶，不同的内切酶可辨认并作用于特 异的DNA序列，并将 DNA切断。 v 常用的限制性内切酶一般是Hind，BamH ,EcoR, EcoRV,Xba,而分子 记则有几个甚至上千个。分子 记 越多，则所构建的图谱就越饱和。构建饱和图谱是RFLP 研究的主要目标之一。 Your company slogan LOGO Your company slogan LOGO Your company slogan LOGO 三种限制性内切酶 如酶的识别位点上如酶的识别位点上 两条两条DNADNA链均未甲链均未甲 基化，就行使内切酶基化，就行使内切酶 功能，但切割点不在功能，但切割点不在 识别位点，而在识别位点，而在1kb1kb （不少于（不少于400bp400bp）或）或nknk b(b(最多最多7kb)7kb)处随机切割处随机切割. . I型酶II型酶III型酶 就是通常指的就是通常指的DNADNA 限制性内切酶，限制性内切酶，IIII型型 限制酶分子量小、仅限制酶分子量小、仅 需需Mg2Mg2作为催化反作为催化反 应辅助因子。它们能应辅助因子。它们能 识别双链识别双链DNADNA的特异顺的特异顺 序，并在这个顺序内进序，并在这个顺序内进 行切割，产生特异的行切割，产生特异的DNDN A A片段。片段。 与与I I型酶特性类似，也型酶特性类似，也 有甲基化功能。不同有甲基化功能。不同 的是它能在的是它能在DNADNA链上链上 的特异位点切割，其的特异位点切割，其 切割位点在识别位切割位点在识别位 点以外，对基因工程点以外，对基因工程 的意义也不大的意义也不大 Your company slogan LOGO RFLP技术的步骤 SouthSouth ernern杂杂 交交 转膜转膜 凝胶电凝胶电 泳分开泳分开 DNADNA片片 段段酶切酶切 不同个不同个 体体DNADNA 的提取的提取 数据分数据分 析析 PCRPCR扩增目的片断扩增目的片断 抽提抽提DNADNA或或PCRPCR扩增后的扩增后的DNADNA经内切酶酶经内切酶酶 切切, , 然后在琼脂糖凝胶电泳分析，适合较然后在琼脂糖凝胶电泳分析，适合较 小分子的小分子的DNADNA分析分析 DNADNA先酶切，电泳分离，变性后转移到尼龙膜先酶切，电泳分离，变性后转移到尼龙膜 或硝酸纤维膜，然后与同位素标记的探针杂交，或硝酸纤维膜，然后与同位素标记的探针杂交， 最后做放射自显形，就可检测出多态性条带。最后做放射自显形，就可检测出多态性条带。 Your company slogan LOGO Your company slogan LOGO Your company slogan LOGO 不同个体DNA的提取 v 1.采用适当的化学试剂裂解细胞，或者用组织匀浆器研磨 破碎组织中的细胞； v 2.用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白质和RNA； v 3.用有机试剂（酚/氯仿）抽提方法去除蛋白质。 Your company slogan LOGO 酶切 v 一般选择一种限制酶来切割DNA分子，但有时为了某些 特殊的目的，分别用不同的限制酶消化基因组DNA。 v 切割DNA的条件可根据不同目的设定，有时可采用部分 和充分消化相结合的方法获得一些具有交叉顺序的DNA 片段。 v 消化DNA后，加入EDTA，65加热灭活限制酶,样品即 可直接进行电泳分离，必要时可进行乙醇沉淀，浓缩 DNA样品后再进行电泳分离。 Your company slogan LOGO 凝胶电泳分开DNA片段 v 在恒定电压下，将DNA样品放在0.81.0%琼脂糖凝胶 中进行电泳，标准的琼脂糖凝胶电泳可分辨70 80000bp的DNA片段，故可对DNA片段进行分离。 v 分辨大片断的DNA需要用浓度较低的胶，分辨小片段 DNA则需要浓度较高的胶。 v 另外为了便于测定待测DNA分子量的大小，往往同时在样 品邻近的泳道中加入已知分子量的DNA样品即标准分子量 DNA （DNA marker）进行电泳。 Your company slogan LOGO 转膜 v 即将凝胶中的单链DNA片段转移到固相支持物上。而此过 程最重要的是保持各DNA片段的相对位置不变。 v DNA是沿与凝胶平面垂直的方向移出并转移到膜上，因此 ，凝胶中的DNA片段虽然在碱变性过程已经变性成单链并 已断裂，转移后各个DNA片段在膜上的相对位置与在凝胶 中的相对位置仍然一样，故而称为印迹（blotting）。 v 用于转膜的固相支持物有多种，包括硝酸纤维素膜（NC 膜）、尼龙（Nylon）膜、化学活化膜和滤纸等，转膜时 可根据不同需要选择不同的固相支持物用于杂交。其中常 用的是NC膜和Nylon膜。 Your company slogan LOGO Your company slogan LOGO Southern杂交 v 基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条 件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度 特异的。 v 转印后的滤膜在预杂交液中温育4-6h，即可加入标记的 探针DNA（探针DNA预先经加热变性成为单链DAN分子 ），即可进行杂交反应。杂交是在相对高离子强度的缓冲 盐溶液中进行。杂交过夜，然后在较高温度下用盐溶液洗 膜。离子强度越低，温度越高，杂交的严格程度越高，也 就是说，只有探针和待测顺序之间有非常高的同源性时， 才能在低盐高温的杂交条件下结合。 Your company slogan LOGO 数据分析 v （一）将滤膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏）。 v （二）在暗室内，将2张X光底片放入曝光暗盒，并用透明 胶代固定，合上暗盒。 v （三）将暗盒置-70低温冰箱中使滤膜对X光底片曝光（ 根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天）。 v （四）从冰箱中取出暗盒，置室温1-2h，使其温度上升至 室温，然后冲洗X光底片（洗片时先洗一张，若感光偏弱 ，则在多加两天曝光时间，再洗第二张片子）。（注：注 意同位素的安全使用） Your company slogan LOGO RFLP技术的应用 v 1. 鉴定是否是需要的DNA片段 v 2. 建立基因组图谱 v 3. 遗传性疾病的研究和诊断 v 研究：根据多态性片段寻找与疾病相关的基因。 v 诊断：直接检测、连锁分析。 Your company slogan LOGO Your company slogan LOGO 苯丙酮尿症连锁分析 父父 （杂合子）（杂合子） 母（杂合子）母（杂合子） EcoREcoR V 30kb /25kb 30kb/25kb V 30kb /25kb 30kb/25kb 患儿患儿（纯合子）（纯