《酶活力及酶》PPT课件.ppt

第三节 酶活力及酶动力学 l一、酶活力 l1、酶活力的测定 l酶活力的表示方法: l酶活力：是指酶催化某以化学反应的能力，可 用在一定条件下酶催化某一化学反应的反应速 度来表示，即单位时间内底物的减少量或产物 的生成量来表示，一般用单位时间内产物生成 量来表示。 lV=S/t和V=P/t lU（酶活力）单位：表示酶量的多少，酶活力 单位与所采用的测定方法，反应条件等因素有 关。国际酶学会提出使用统一的国际单位IU， 即最适条件下25，每分钟催化1微摩尔底物 所需要的酶量。 l2、酶的比活力 l比活力=活力单位系数/每毫克酶蛋白 l是表示酶纯度的一个指标。 l3、酶转换系数 l表示酶的催化中心，每个活性中心或酶分子底 物转换底物的分子数。 4、酶活力的测定： l比色法：产物与试剂生成有色物质，根据颜色深浅来 计算。 分光光度法：底物和产物光吸收性质不同，可根据吸 收光谱的变化来计算。 l滴定法：产物之一是酸或碱可以使用此法。 l量气法。 l同位素测定法。 l酶联法：S+E SE1 D+E2 DE2 l F lD：不能检测或不容易检测 lF：容易检测 l旋光法 l量热法 l层析 计算题 l 1、有1克淀粉酶制剂，用水溶解成1000毫升，从中取 出1毫升测定淀粉酶活力，测得每5分钟分解0.25克淀粉。 计算每克酶制剂所含的淀粉酶活力单位。（淀粉酶活力单 位的定义是：最适条件下每小时分解1克淀粉的酶量称为1 个活力单位。） l 解：1、由题可知，1/1000克的淀粉酶能在5分钟内 分解0.25克淀粉，1小时内1/1000克的淀粉酶能分解的淀 粉为：0.25（60/5）=3克； l 2、由淀粉酶活力单位定义（每小时分解1克淀 粉的酶量称为1个活力单位），可知1/1000克的淀粉酶的 活力单位为：3； l 3、所以，1克的淀粉酶制剂的活力单位为 31000=3000。 l2、 用AgNO3对在10毫升含有1.0毫克/毫升蛋白质的纯酶溶液进行 全抑制，需用0.342微摩尔AgNO3，求该酶的最低分子量。 l 答：1、已知酶溶液的浓度是1.0毫克/毫升，体积是10毫升， 因此该酶溶液中所含的酶蛋白质量应为：1.0毫克/毫升10毫升 =10毫克； l 2、 而所用的抑制剂AgNO3的物质的量为0.342微摩尔，因 为是求酶的最低分子量，则可假设酶只含一个活性中心，抑制剂 与酶的作用关系是等分子数进行，则该酶溶液中所含酶的物质的 量即为：0.342微摩尔。 l 3、 因此该酶的最低分子量为：10毫克/0.342微摩尔 =2.92104。 2、影响酶作用的因素 1)、酶浓度对酶反应速度的影响 在有足够底物和其他条件不变的情况下，反应 速度与酶浓度成正比 。 当SE时，V=K3E 2)、底物 3)、温度对酶反应速度的影响 一方面是温度升高,酶促 反应速度加快。 另一方面,温度升高,酶 的高级结构将发生变化 或变性，导致酶活性降 低甚至丧失。 因此大多数酶都有一个 最适温度。 在最适温度 条件下,反应速度最大。 最适温度不是一个固定的常数，它随底物的种类 、浓度, 溶液的离子强度, pH, 反应时间等的影响。 例: 反应时间短，最适温度高。 反应时间长，最适温度低。 4)、pH对酶反应速度的影响 酶反应的最适pH（optimum pH） 酶的最适pH也不是一个固定的常数，它受到 底物的种类、浓度; 缓冲液的种类、浓度; 酶的纯 度;反应的温度、时间等的影响。 例: 碱性磷酸酶催化磷酸苯酯水解时 s为2.5x10-5 M，最适pH为 8.3 s为2.5x10-2 M，最适pH为10.0 pH影响反应速度的原因 ( 1 ) pH影响了酶分子、底物分子和ES复合物的 解离状态。 ( 2 ) 过高、过低的pH导致酶蛋白变性。 5)、激活剂对酶反应速度的影响 酶的激活剂 1. 无机离子 （1）一些金属离子，如Na+、K+、Mg2+、Ca2+、 Cu2+、Zn2+、Fe2+等。 （2）阴离子：如Cl-、Br-、I-、CN- 等 （3）氢离子 凡能提高酶活力的物质都是酶的激活剂。如 ：Cl-是唾液淀粉酶的激活剂。 2. 有机分子 还原剂：抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽 金属螯合剂：EDTA 激活酶原的酶 6)、抑制剂对酶活性的影响 l使酶的活性降低或丧失的现象，称为酶的抑制作用 。能够引起酶的抑制作用的化合物则称为抑制剂。 抑制剂并非变性剂，抑制剂具有不同程度的选择性 。 l酶的抑制剂一般具备两个方面的特点： a.在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过 渡状态相似。 b.能够与酶以非共价或共价的方式形成比较稳定 的复合体或结合物。 抑制剂类型和特点 竞争性抑制剂 可逆抑制剂 非竞争性抑制剂 反竞争性抑制剂 非专一性不可逆抑制剂 不可逆抑制剂 专一性不可逆抑制剂 抑制作用的类型： (一)不可逆抑制作用： 抑制剂与酶反应中心的 活性基团以共价形式结 合，引起酶的永久性失 活。如有机磷毒剂二异 丙基氟磷酸酯。 抑制胆碱酯酶活性， 使乙酰胆碱不能被分解成 乙酸和胆碱，引起乙酰胆 碱的积累，使神经处于过 渡兴奋状态，因此此类化 合物又称神经毒气。 有机磷化合物：抑制蛋白酶或酯酶活性 敌敌畏 敌百虫 萨林 有机砷化合物：与酶的巯基结合而抑制活性 路易斯毒气 （二）可逆抑制作用(reversible inhibition) E+I EI 抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活 性暂时性丧失。抑制剂可以通过透析等方法被 除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。 二、酶动力学 l1、单底物酶促反应动力学 1913年，德国化学家Michaelis和Menten根据中间 产物学说对酶促反应的动力学进行研究，推导出了表 示整个反应中底物浓度和反应速度关系的著名公式， 称为米氏方程。 根据中间产物学说，酶促反应分两步进行根据中间产物学说，酶促反应分两步进行: : 米氏方程的推导： 米氏方程 n当反应速度等于最大速度 一半时,即V = 1/2 Vmax, Km = S n上式表示,米氏常数是反 应速度为最大值的一半时的 底物浓度。 n因此,米氏常数的单位为 mol/L。 米氏常数的意义及测定 Km 米氏常数 Vmax 最大反应速度 当底物浓度较低时 反应速度与底物浓度成正比；反 应为一级反应。 SS V V VmaxVmax 随着底物浓度的增高 反应速度不再成正比例加速；反应 为混合级反应。 SS V V VmaxVmax 当底物浓度高达一定程度 反应速度不再增加，达最大速度； 反应为零级反应 SS V V VmaxVmax 米氏常数Km的意义 l不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要 的特征物理常数。 lKm值只是在固定的底物，一定的温度和pH条 件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件 下具有不同的Km值。 lKm值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大 表示亲和程度小，酶的催化活性低; Km值小 表示亲和程度大,酶的催化活性高。 米氏常数的测定 基本原则：将米氏方程变化成相当于y=ax+b的 直线方程，再用作图法求出Km。 1 Km 1 1 = + V Vmax S Vmax A. A. 取米氏方程式的倒数形式取米氏方程式的倒数形式： 1/Vmax 斜率=Km/Vmax -1/Km 米氏常数Km的测定： B、E-H法 l两边分别乘以Km+SS，得 v=-Kmv/S+Vmax 酶的Km在实际应用中的意义 l鉴定酶：通过测定Km，可鉴别不同来源或相同来源 但在不同发育阶段，不同生理状态下催化相同反应的 酶是否是属于同一种酶。 l判断酶的最适底物（天然底物） 。 l计算一定速度下底物浓度。 l了解酶的底物在体内具有的浓度水平。 l判断反应方向或趋势。 l判断抑制类型。 可逆抑制(reversible inhibition) 及其动力学 E+I EI 可逆抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起 酶活性暂时性丧失。抑制剂可以通过透析等方 法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。 根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为三类 。 1. 竟争性抑制 某些抑制剂的化学结构与底 物相似，因而能与底物竟争 与酶活性中心结合。当抑制 剂与活性中心结合后，底物 被排斥在反应中心之外，其 结果是酶促反应被抑制了。 + I EI ES P+ E E+S 竞争性抑制作用 实例：磺胺药物的药用机理 H2N- -SO2NH2 对氨基苯磺酰胺 H2N- -COOH 对氨基苯甲酸 对氨基苯甲酸谷氨酸蝶呤 叶酸 FH2 磺胺类药物可与对氨 基苯甲酸竞争二氢叶 酸合成酶，影响FH2 的合成，导致细菌生 长繁殖受抑制，达到 治病效果。 例: 丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用 此酶的竞争性抑制剂还有： 竞争性抑制作用动力学 E = Ef + ES + EI Vmax = k3 E v = k3ES Vmax v =Ef + ES + EI ES Km = EfS ES Ef=ES Km S Ki = EfI EI EI=Ef I Ki 竞争性抑制作用动力学 竞争性抑制作用特点： 1）竞争性抑制剂的结构与底物结构十分相似， 二者竞争酶的结合部位。 4）Vmax不变，Km增大 2）抑制程度取决于I和S 的浓度以及与酶结合的 亲和力大小。 S v V/2 kmkm 无 I 有 I 3）可以通过增大底物 浓度，即提高底物的竞 争能力来消除。 2. 非竟争性抑制 l酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化， 并导致酶活性下降。抑制剂与活性中心以外的基团结合 ，不与底物竞争酶的活性中心，所以称为非竞争性抑制 剂。 l如某些金属离子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常 能与酶分子的调控部位中的-SH基团作用，改变酶的空 间构象，引起非竞争性抑制。 非竞争性抑制作用 + I EI+SESI ES P+ E E+S + I 实例：重金属离子（Cu2+、Hg2+、Ag+、Pb2+） 金属络合剂（EDTA、F-、CN-、N3-） 非竞争性抑制特点： 1）抑制剂与底物结构不相似，抑制剂与酶活性 中心以外的基团结合。 2）Vm下降，Km不变 3）非竟争性抑制不能通过增大底物浓度的方法 来消除。 S v 无 I V/2 km 有 I () 非竞争性抑制作用动力学 3、反竞争性抑制作用 ESI ES P+ E E+S + I 酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合，引起酶 活性下降。 反竞争性抑制特点： 1）抑制剂与酶和底物的复合物结合。 2）Km和Vm下降 3）底物浓度增加，抑制作用加强。 反竞争性抑制作用动力学 有无抑制剂存在时酶促反应的动力学方程 表观 2、双底物酶促反应动力学 l一）、顺序机制：底物的结合和产物的释放按 一定顺序进行。 lA、有序顺序，为底物，为底物。 lB、随机顺序，为底物，为底物。 序列机制的底物动力学方程及动力学图 在B的浓度达到饱和时A的米氏常数 在A的浓度达到饱和时B的米氏常数 底物A与酶结合的解离常数 底物A、B都达到饱和时最大反应速率 随第二个底物浓度的增加， Km降低和Vm提高 l二）、乒乓机制：底物与酶结合和产物的释放 是交替进行的。为底物，为底物 。 （2）乒乓机制的底物动力学方程及动力学图 在B的浓度达到饱和时A的米氏常数 在A的浓度达到饱和时B的米氏常数 底物A、B都达到饱和时最大反应速率 随第二个底物浓度的增加， Km和Vm均提高 三）、非米氏酶反应动力学， Rs协同指数或饱和比值。 别构酶与非调节酶动力学曲线的比较 例题 l为了确定某酶的催化反应的初速度的底物依赖关系，制备了一 系列的l00ml含有不同底物浓度的反应混合物。向每个混合物 加入相同量的酶后便开始反应。通过测定每单位时间（分钟） 所形成的产物量而获得催化反应的初速度，其结果如下表所示 。 底物浓度 (mol/L) 1106 5106 11