中药化学成分的一般研究方法-2.ppt

第二章 中药化学成分的一般研究 方法 中药化学成分 类型 分类 糖类 苷类 醌类 苯丙素类 黄酮类 萜类和挥发油 生物碱 甾体类 三萜类 鞣质 (一) 糖类 Carbohydrates，是多羟基醛或多羟基酮及其衍生物、聚合物 的总称。 单糖 低聚糖 多糖 D-葡萄糖 D-甘露糖 D-半乳糖 例如：糖 + 苷元 苷 (明显的生理活性) (二) 苷类 糖 糖 糖 苷元 苷 苷元 (三) 醌类化合物 (四) 苯丙素类化合物 香豆素 伞形花内酯 daphnin (五) 黄酮类化合物 (六) 萜类和挥发油 薄荷醇 龙脑 穿心莲内酯 (七) 三萜类化合物 三萜皂苷 酸性皂苷 (八) 甾体类化合物 (九)生物碱 原小檗碱 小檗碱 延胡索乙素 (十) 鞣质 单宁或鞣酸 (+)儿茶素 （+）表儿茶素 酸性成分 黄酮、蒽醌、香豆素、 有机酸、鞣质 中性成分 强心苷、皂苷（ 甾体） 碱性成分 生物碱 两性成分 两性生物碱（含 COOH 、OH 等 ） 极性分类 脂溶性成分：苷元、生物碱 水溶性成分：苷、生物碱盐 按溶解性分类 生物合成 途径 生物合成 一次代谢 糖、蛋白质 、脂质、核 酸 二次代谢 生物碱、萜 等 醋酸丙二酸 途径：AA MA 乙酰辅酶莽草酸 葡萄糖代谢 甲戊二羟酸 途径：MVA 桂皮酸 途径 氨基酸 途径 饱和 脂肪酸 酚类 蒽醌 萘醌 甲戊二羟酸 焦磷酸二甲烯丙酯 萜类 甾体 苯丙氨酸 （酪氨酸）生物碱 香豆素 黄酮 木脂素 绿色植物含有叶绿素，光合作用将 乙酸-丙二酸途径 (acetate-malonate pathway，AA-MA途径) (Cn+2，n为偶数) 甲戊二羟酸途径(mevalonic acid pathway，MVA途径) 单萜 倍半萜类 二萜类 甲戊二羟酸 MVA 三萜类 甾体 类胡萝卜素 反式角鲨烯 (四) 氨基酸途径(amino acid pathway) 大多数生物碱类成分由此途径生成。有些氨基酸， 如鸟氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸等， 经脱羧成为胺类, 再经过一系列化学反应(甲基化、氧化 、还原、重排等) 生成各种生物碱 (三)莽草酸途径(shikimic acid pathway) 此途径由莽草酸通过苯丙氨酸，生成桂皮酸， 再由桂皮酸生成各种苯丙素类化合物。现也被称为 桂皮酸途径 。 (五)复合途 径 许多二级代谢产物由上述生物合成的复合途径生成。即分子中各个 部分由不同的生物合成途径产生。如查耳酮类、二氢黄酮类化合物的A 环和B环分别由乙酸-丙二酸途径和莽草酸途径生成。一些萜类生物碱分 别来自甲戊二羟酸途径及莽草酸途径或乙酸-丙二酸途径。 提取分离方法 溶剂提取法 超临界流体提取法 水蒸气蒸馏法 溶剂提取 法 原理： 根据中药化学成分与溶剂间“极性相似相溶”的原理，依据各类成分溶 解度的差异，选择对所提成分溶解度大、对杂质溶解度小的溶剂，依据“ 浓度差”原理，将所提成分从药材中溶解出来的方法。 1影响化合物极性的因素： (1) 化合物分子母核大小（碳数多少）：分子大、碳数多，极性小；分子 小、碳数少，极性大。 (2) 取代基极性大小：在化合物母核相同或相近情况下，化合物极性大 小主要取决于取代基极性大小。 极性大小顺序；酸酚醇胺醛酮酯醚烯烷 举例：判断下列各组化合物极性大小 A B C 麻黄碱 蝙蝠葛碱 2 常见中药化学成分类型的极性： 极性较大的：苷类、生物碱盐、糖类、蛋白质、氨 基酸、鞣质、小分子有机酸、亲水性色素。 极性小的：游离生物碱、苷元、挥发油、树脂、脂 肪、大分子有机酸、亲脂性色素。 对溶剂的要求 1、溶解度 2、不能发生化学反应 3、安全无毒经济易得 4、沸点易适中，便于回收，反复使用 水： 生物碱盐、苷类、有机酸盐、糖 冷水：发生酶解反应，杂质多 热水：效率高，挥发性成分损失，热敏性成分易破 坏 亲水性有机溶剂：MeOH、EtOH、Me2CO等 亲脂性有机溶剂：CHCl3、Et2O、Ben、Et2OAc 常用溶剂： 常用溶剂极性水(H2O) 甲醇(MeOH) 乙醇(EtOH) 丙酮（Me2CO） 正丁醇(n-BuOH) 乙酸乙酯(EtOAc) 乙醚(Et2O) 氯仿(CHCl3 ) 苯（C6H6) 四氯化碳(CCl4) 极性小 极性大 不溶于水 正己烷石油醚(Pet.et) 煎煮法 浸渍法 渗漉法 回流提取法 连续回流提取法 （索氏提取法） 提取方法 特点 超临界流体密度液体 超临界流体粘度气体 优点 1、萃取能力强，大大提高效率 2、温度低，热敏性、易氧化分解 的物质不易破坏 3、时间短，24小时可完成 4、提取物无溶剂残留物 5、提取物质量稳定，标准易控制 CO2超临界流体提取法 适用能随水蒸气蒸馏而不被破坏的化合物，且不与 水发生反应。用于挥发油成分：例如麻黄碱、丹皮素、 大蒜素。 其它方法 升华法 组织破碎提取法 压榨法 超声提取法 微波提取法 水蒸气蒸馏 溶剂法 分离精制方 法 酸碱溶剂法 溶剂分配法 系统溶剂萃取法 逆流分溶法（CCD） 液滴逆流色谱（DCCC ） 原理：利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂 中分配系数不同而达到分离的目的 K（分配系数）= Corg CH 2 O 例：A、B两种物质在CHCl3及H2O分配，A、B均为1g，KA=10， KB=0.1 ，VCHCl3/H2O=1:1，振摇分配平衡后，90%以上溶质A在上相，10%在A 在下相。=KA/KB=10/0.1=100 100 一次分离 100 10 则1012次分离 2 100次以上分离 1 KA KB，两者性质及其相近无法分离 分离因子越大，分离效率越高 萃 取 法 萃取条件选择： 在一定温度下，两种溶液 不互溶，振摇分层 若所要成分为亲水性物质 水 弱亲水性有机溶剂 若所要成分为脂溶性物质 水 有机溶剂：氯仿、乙醚 乳化现象处理方法： 乳化层分离出，长时 间放置 加热破坏乳化层 用滤纸自然过滤 逆流分溶法（ CCD） 液滴逆流色谱（ DCCC） 液滴逆流色谱 Pb2+ 醋酸铅（中性、碱性） phOH COOH 铅盐 盐 酸碱 酸/碱生物碱 生物碱 碱/酸络盐黄酮 黄酮 碱酸 有效成分 杂质 杂质溶解 有效成分溶解 有效成分 杂质 沉淀剂 沉淀剂：乙醇 水/醇法 （除去糖、蛋白质等水溶性杂质） 醇/水法 （除去树脂、叶绿素水不溶性杂质） 醇/醚法 （沉淀皂苷成分与脂溶性杂质分离） 沉 淀 法 分馏法 （沸点） 膜分离法 （外加压力或化学位差 分子大小） 升华法 提取液 过滤 滤液 浓缩 降温 结晶 母液 结晶析出条件： 1）有效成分浓度高 2）选择合适的溶剂 3）温度不同引起溶解度的改变 4）加速结晶的措施，加晶种 结晶 法 吸附色 谱 凝胶过 滤色谱离子交 换色谱 大孔树脂 色谱 分配色 谱 色谱分离 法 吸附色谱 硅胶 氧化铝：极性吸附 活性炭：非极性吸附 聚酰胺：氢键吸附 (酰胺羰基与酚类、黄酮类化合物的酚羟基 ，或酰胺键上的游离胺基与醌类、脂肪羧 酸上的羰基) 水 甲醇 丙酮 氢氧化钠 水溶液 甲酰胺 二甲基甲酰胺 尿素水溶液 洗脱能力 弱 强 凝胶过滤色谱（凝胶渗透色谱、分子筛滤过、排阻色谱 ） 原理：分子筛作用 葡聚糖凝胶（sephadex G） 羟丙基葡聚糖凝胶(sephadex LH-20) 大孔吸附树脂 原理：吸附性和分子筛性原理相结合 吸附性：范德华引力或氢键的 分子筛：多孔性 应用：糖与苷的分离、生物碱的精制 分配色谱 原理：被分离成分在固定相和流动相之间的 分配系数不同 正相分配色谱：流动相极性固定相极性 HPLC、MPLC、LPLC 中药有效成分化学结构的研 究方法 新药开发 选定研究对象 收集原料筛选活性 有活性动物实验 制剂工业化研究 申报临床研究 （期临床、 期临床） 申报新药证书及生产批准文号 试生产 期临床实验（安全性考察） 正式生产 1H-NMR：早 13C-NMR：晚 核磁共振谱（NMR） S/N S/N = 13C 1H = 3 3 =(1/4)3=1/64 倍 检测灵敏度太低 1）13C 的自然丰度低，自然界中 13C 是 12C 的1.1%（而 1H 是98.88%） 2） 13C 磁旋比=6.726 1H 磁旋比=26.752 NMR信号强度 3 13C谱测定的灵敏度只有1H 的1/600 解决办法： 脉冲付里叶变换技术和计算机，扫描次数累积，信号 不断增强 碳谱的特点及提供的信息 1、优点：化学位移范围大，分辨率高 13C : 0250 ppm 1H : 020 ppm 谱线简单，易解析 直接提供C骨架信息（ 、J） 2、缺点：需用样品多 测定时间长 仪器要求高 吸收强度不与C数目成正比， 不代表C原子个数 杂化方式 诱导效应 共轭效应 取代基构型影响 影响因素： 3、提供信息 1） 13C 信号的化学位移0250 ppm 信号之间很少重叠，识 别起来比较容易 化学位移与C原子杂化方式、与周围化学环境有关， 可判断C原子类型 sp 3 sp sp 2 20100 ppm 70130 ppm 100200 ppm 烷烃 炔烃 烯烃 2) 13C的信号裂分 13C与1H均为磁性核，自旋偶合互相干扰，使对方 信号裂分 H谱中13C核干扰极少，乎略不及，只有1H-1H同核 偶合 C谱中，13C自然丰度太低， 13C -13C相连几率只有 0.1%，同核偶合影响一般忽略，但是异核1H - 13C偶合十分突出 H核自旋偶合干扰产生的裂分数目遵守n+1规律， 13C信号表示为q (CH 3)+(CH2) d (CH2) s ( C ) BA (四) 13C-NMR技术图谱 1、噪音去偶谱（全氢去偶谱、宽带去偶谱） 特点：采用宽频（1000Hz）的电磁辐射照射样品，消除 所有H核对所磁核的偶合，所有13C信号，在图谱 上作为单峰（单线）出现 简化图谱，每个峰代表一种类型C，对判断十分方便 照射H后，产生NOE效应，连有1H的13C信号强度增加 ，但季C不连有 H，信号为较弱的吸收峰。 NOE效应：一对相关峰(A、B) 照射A， 则A消失，B峰增强，照射B，则B消失, A峰增强。 CH2 CH2 CH 2、偏共振去偶(ORD) 质子噪音去偶消除了全部13C 1H偶合，得不到 C与H相连的许多结构信息，采用偏共振去偶测得C核 信号由于连接H核的数目不同而产生不同裂分， CH3(q) CH2 (t) CH(d) 季C(s)区别伯、仲、叔、季碳原子。 INEPT谱：不灵敏核极化转增强法 DEPT谱：无畸变极化转移增强法 3、 新技术：通过改变照射1H核的脉冲宽度或设定不同的 驰预时间 特点：在图谱上不同类型的13C信号呈单峰形成，分别 朝上或朝下，灵敏度高，信号之间不重叠 解析化学位移 (分四大区) 相同：没有对称结构，各C结构不同 不相同：谱线数少于碳数，分子中有对称结构 谱线数多于碳数（溶剂峰，异构体峰，杂质峰 ， 分子式测得不准） 一级解析过程 1、充分了解样品基本数据(分子量、分子式、可能含有的基团) 2、求不饱和度= +/2 + /2 + 1 (：四价原子C 、S ：三价原子N、P ：一价原子H、X) 3、测1H谱 4、测13C谱 计算谱线数是否与C数相同 040 脂C区 4080 取代脂C区 80150 芳烯C区 150200 羰基区 200 150 100 90 80 40 20 0 旋光光谱 (ORD) A. 正性 B. 负性 Cotton 谱线 化合物分子手性中心邻近有发色团，在发色团吸 收波长区域附近，旋光度发生显著变化，产生峰和谷 的现象称为Cotton效应，所绘制的谱图称为Cotton谱 线 图2-18 5- 胆甾酮 的Cotton谱线 实线（A） 天然胆甾酮(+)Cotton 虚线（B） 绝对构型相