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第三节 DNA生物合成过程 DNA合成期 一、复制的起始 几个相关概念： 1. 复制起始点 (origin, ori) 原核生物只有一个复制起始点 ； 真核生物染色体DNA有多个 复制起始 点，同时形成多个复制单位， 两个起始 点 之间的DNA片段称为复制子(replicon)。 2. 复制叉 (replication fork) 复制时双链打开，分开成两股， 新链沿 着张开的模板生成，复制中形成的这种 Y 字形的结构称为复制叉。 3. 双向复制 (bidirectional replication) 原核 生物的复制是从一 个起始点开始，同 时向两个方向进行 ，称为双向复制。 复制中的DNA成为 状。 DNA复制的起始就是要解开双链和生 成 引物。 (一)DNA解成单链 由拓扑异构酶松弛超螺旋，解螺旋 酶 解开双链，SSB结合到单链上使其稳定。 复制起始的 解链需要多种蛋白质参 与。这些蛋白质与复制 起始点的特有序列结合 ，促使其邻近的DNA解 链。 (二)引物合成 引发体引导引物酶到达适当的位置合成引物 。 Dna A Dna B、 Dna C DNA拓扑异构酶 引物 酶 SSB 3 5 3 5 引发体和引物 含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA 复制起始区域的复合结构称为引发体。 3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。 引物 3 HO 5 引物 酶 引物长度约为十几个到几十个 核 苷酸不等。引物的合成方向也是 53 方向。DNA的聚合就是在引物的3 OH 上进行的。 二、复制的延长 在DNA聚合酶催化下，以 解开的 单链为模板，以四种dNTP为原料， 进 行聚合作用。即新进入的 dNTP 与 引物 3OH形成磷酸二酯键，由53 方 向延长子链。 5 3 5 dATP dGTP dTTP dCTP dTTP dGTPdATP dCTP OH 3 3 DNA-pol 目 录 模板方向35 合成需要引物提供3-OH 合成方向53 底物是dNTP (一) 半不连续复制 领头链 (leading strand) 顺着解链方向生成的子链，其 复制是 连续进行的，得到一条连续的子链 。 领头链的合成 目 录 随从链 (lagging strand) 复制方向与解链方向相反，须 等解开 足够长度的模板链才能继续复制，得到 的子链由不连续的片段所组成。 冈崎片段： 1968年日本生化学者冈崎用电镜及放射 自显影技术，观察到DNA复制中出现一 些不连续的片段，因而将这些不连续的 片段称为冈崎片段。 原核生物的冈崎片段为一至二千个核苷 酸，真核生物约为数百个核苷酸。 随从链的合成 目 录 (二) 滚环复制 (rolling circle replication) 一些简单低等生物或染色体以外的 DNA 复制的特殊形式。 三、复制的终止 1. 随从链不连续片段的连接 2. 原核生物在复制终止点的汇 合 3. 真核生物端粒的合成 (一)不连续片段的连接 (二)原核生物复制的终止 原核生物环状DNA为双向 复制， 复制片段在复制的终止点汇合。每个 方向的领头链和相反方向的随从链的 连接与不连续片段的连接相同。 原核生物基因是环状DNA，双向复制的 复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。 (三)真核生物复制的终止 染色体DNA呈线性，复制在末端停 止。 哺乳动物的 细胞周期 DNA合成期 G1 G2 S M 二、真核生物的DNA生物合成 细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这 两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋 白激酶活性有关。 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复 制因子而实施调控作用。 真核生物每个染色体有多个起始点， 是多复制子复制。复制有时序性，即复 制子以分组方式激活而不是同步起动。 复制的起始需要DNA-pol（引物酶 活性）和pol（解螺旋酶活性）参与。 还需拓扑酶和复制因子(replication factor, RF)。 Pol合成RNA引物后继续合成短的 DNA （一）复制的起始 增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在复制起始和延长中起关键作用 。 三聚体中空管，为滑卡 复制因子C （replication factor C,RF-C）由5 种亚基组成，有ATP的结合位点，是PCNA的装 卡器 复制因子A（replication factor A,RF-A)是单链 DNA结合蛋白 ARS 3 5 5 3 领头链 3 5 3 5 亲代DNA 随从链 引物 核小体 （二）复制的延长 染色体DNA呈线状，复制在末端停止。 复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。 染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物， 去除后留下空隙。 （三）复制的终止 5 3 oriorioriori 5 3 5 5 3 3 5 5 3 复制子 3 复制子 端粒(telomere) 真核生物染色体线性DNA 分子末 端的结构。 结构特点： 1. 由末端单链DNA序列和蛋白质构成 2. 末端DNA序列是多次重复的富含G、 C 碱基的短序列 功能：1. 维持染色体的稳定性 2. 维持DNA复制的完整性 端粒酶(telomerase) 特点： 1. 由RNA和蛋白质构成的复合物 2. 为特殊的逆转录酶，能以自身的RNA 为 模板逆转录合成端粒DNA 功能： 合成端粒DNA，维持端粒的长度 爬行模型： 端粒及端粒酶的意义： 端粒的长短及端粒酶活性变 化与细胞水平的老化(aging)及 肿瘤的发生有一定关系。 （五）真核生物DNA复制特点 1.复制速度慢 真核生物基因组复制先要解开核小体， 复制叉前进的速度慢。真核生物基因组复制速度 大约每秒钟50个核苷酸，仅为原核生物的十分之 一。 2.多起点复制 真核生物的每条染色体上都有多个复制 起点，这些复制起点可同时或先后发动复制。真 核生物的复制叉行进速度虽慢，但由于复制的起 点多，复制子小，整个DNA复制的速度还是快速 的。 3.引物及岗崎片段的长度均小于原核生 物 动物细胞中引物长度约10个核苷酸 ，岗崎片段长约100-200个核苷酸。真核生 物岗崎片段的长度可能和核小体的结构有 关。 引物中混有DNA 4.组蛋白合成与DNA复制同步 组蛋白的合成也在细胞的S期，与 DNA复制同步进行。组蛋白和DNA组装成 核小体。 5.真核生物染色体全部复制完成以前不 会发动新一轮复制。 复制的基本规律 Basic Rules of DNA Replication 第三节 半保留复制(semi-conservative replication) 双向复制(bidirectional replication) 半不连续复制(semi-discontinuous replication) 条件： DNA模板35 RNA引物提供3-OH dNTP 底物 DNA聚合方向53 复制的高保真性(high fidelity) 1. 遵守严格的碱基配对规律； 2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能； 3. 复制出错时DNA-pol的及时校读功能。 DNA复制的保真性至少要依赖三种机制 DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读 A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用 其聚合活性掺入正确配对的底物。 B：碱基配对正确， DNA-pol不表现活性。 逆转录和其他复制方式 Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways 第四节 逆转录酶(reverse transcriptase) 逆转录(reverse transcription) 逆转录酶 一、逆转录病毒和逆转录酶 逆转录病毒细胞内的逆转录现象 RNA 模板 逆转录酶 DNA-RNA 杂化双链 RNA酶 单链DNA 逆转录酶 双链DNA 逆转录酶 A AA A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶 碱水解 T T T T 分子生物学研究可应用逆 转录酶，作为获取基因工程目 的基因的重要方法之一，此法 称为cDNA法。 以mRNA为模板，经逆转 录合成的与mRNA碱基序列互 补的DNA链。 试管内合成cDNA cDNA complementary DNA 二、逆转录研究的意义 逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中 的重大发现。 逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样 兼有遗传信息传代与表达功能。 对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意 到的病毒致癌理论。 滚环复制(roll