DNA分子标记的种类.ppt

DNA分子标记的种类以及进展 分子标记的定义 l广义的分子标记(molecular marker)是指可遗 传的并可检测的DNA序列或蛋白质。 l狭义的分子标记概念只是指DNA标记，而这个 界定现在被广泛采纳。 理想分子标记的界定 (1)具有高的多态性 (2)共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂台和纯台基因型 (3)能明确辨别等位基因； (4)遍布整个基因组； (5)除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组； (6)选择中性(即无基因多效性)； (7)检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)； (8)开发成本和使用成本尽量低廉； (9)在实验室内和实验空间重复性好(便于数据交换)。 但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满 足以上所有要求 DNA分子标记分类 一、第一代分子标记技术 以southern杂交为核心的分子标记技术：RELP标记等 二、第二代分子标记技术 基于PCR的DNA分子标记：RAPD标记、ISSR标记、SSR标 记、STS标记等 基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记：AFLP标记、 CAPS标记等 三、第三代分子标记技术 基于单核苷酸多态性的DNA分子标记:SNP标记 四、其他几种新型分子标记 一、第一代分子标记技术 限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，缩写RFLP) 是发展最早的分子标记技术。RFLP技术的原 理是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的 特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶切 位点变异的突变如点突变(新产生和去除酶切 位点)和一段DNA的重新组织(如插人和缺失造 成酶切位点问的长度发生变化)等均可导致 RFLP的产生。 流程图 酶切电泳 标记探 针杂交 分析 一般选择单拷贝探针 如果RFLP探针是来自拷贝数可变串联重复(Varible number of tandem repeats，缩VNTR)则产生另一类 因相同或相近序列的拷贝数变化所起的多态性。凡是 引起复单位的大小和序列不同、基因组中重复的数目 和分布不同等均可导致这种多态性的产生。在RFLP技 术中成为分子标记的重复序列包括：(1)小卫星 (minisatellite)序列：重复单位(motif)约有碱基l060个( 也有16100个碱基一说)，在基因组中多次出现。(2) 微卫星(microsatelite) 或简单重复序列 (simple sepuencerepeats，缩写SSR)：重复单位含有15碱 基(也有28个碱基一说) 二、第二代分子标记技术 1、 基于PCR的DNA分子标记 随机引物PCR标记：RAPD标记、ISSR标、 AP-PCR、DAF等 特异引物PCR标记:SSR标记、STS标记、 SCAR、SPAR、SSCAP、ddF等 2、基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记 限制性酶切片段的选择性扩增来显示片段的多 态性：AFLP标记等 对PCR扩增片段的限制性酶切来揭示扩增区段 的多态性：CAPS标记等 1.1.1随机扩增多态性DNA(RAPD) 该技术用一个(有时用两个)随机引物(一般810个碱基)非 定点地扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分开扩增片段。不需要 DNA探针，用一个引物可扩增多个片段，技术简单，只需少量 的DNA样本，成本较低，RAPD标记一般是显性遗传（极少数 是共显性），但是RAPD分析中重复性不高，由于共迁移的存 在，在不同个体中出现相同分子量的滞后，并不能保证这些个 体拥有同一条(同源）的片段 实验步骤 PCR电泳分析 应用 RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测 ，也可用于构建基因组指纹图谱。 1、品种鉴定、系谱分析：用于识别种群、家族 、 种内或种间的遗传变异，为生物血缘关系 或分类提供依据，还可以分析混合基因组样品 等。 2、基因定位：例如定位了莴苣霜霉病抗性基因 。 RAPD技术的发展和相近的分子标记种类 lDAF(DNA amplification fingerprinting）：与RAPD技术不同 的是，在DAF分析中，引物浓度更高，引物长度更短（一般58 个碱基）只有两个温度循环，并且往往用聚丙烯酰胺凝胶电泳， DAF通常会产生非常复杂的带型。在DAF技术的基础上，又展出 ASAP技术。 lAP PCR(arbitrarily primed poymerase chain reaclion) ： 在APPCR分析中，扩增分为三个部分，每个部分要求的条件 和组分的浓度存在差异；在第一个PCR循环中，引物浓度较高； 引物长度不定，并且常常来自为其它目的而设计的引物 lMAAP(Multiple Arbitrary Punplicon Profiling)：这是 CaetanoAnolle（1994）创造的一个词，想用来统称所有这些 相关技术，但迄今为止这个词很少使用 1.1.2加锚微卫星寡核苷酸(Anchored mi cmsatellite oligonucleotides） Zietkiewicz et a1(1994)对STMS技术进行 了发展，他们用加锚微卫星寡核苷酸作引物， 对基因组节段而不是重复序列本身进行扩增。 在SSR的5 端或3 端加上24个随机选择的 核苷酸，这可引起特点位点退火。这样就能导 致位于反向排列的间隔不太大的重复序列间的 基因组节段进行PCR扩增。这类标记又被称为 ISSR、ASSR或AMP-PCR。 1.1.3任意引物PCR (Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction， AP PCR） 在APPCR分析中，所使用的引物较长（10 50 bp) ， PCR反应分为两个阶段，首先寡核 苷酸引物在低严谨条件下与模板DNA退火，此时 发生了一些合成，以便稳定模板与引物之间相互 作用。然后进行高严谨退火条件的循环，两个位 点间那些序列在低严谨度退火条件下发生的引物 延伸可继续在高严谨条件下扩增。采用变性聚丙 烯酰胺凝胶电泳分析PCR产物，最终反应结果与 RAPD类似。只要设计的引物在低严谨退火条件 下能减少引物产生人为产物，应用成对组合的引 物可以产生新的APPC R谱带， 但引物配对组合使用时，得到的图谱与单引物 单独使用时产生的图谱之和很不相同，这样， 50个引物能产生1250种不同指纹图谱。 APPCR方法不需预知序列资料，而且检 测的基因组样本是任意的，还能够用于检测近 等基因系（或同类系）中的多态性。AP-PCR 的缺点是每个新的多态性都必须经纯化才能进 一步使用。另外，此方法在杂合体中仅可辨别 长度多态性。 1.1.4 DNA扩增指纹印迹 (DNA Amplification Fingerprinting，DAF) DAF是一种改进的RAPD分析技术，与RAPD技 术不同的是，DAF分析中所使用的引物浓度更高 ，长度更短（一般为5一8 bp），因此它所提供的 谱带信息比RAPD大得多，如当使用5个核苷酸的 引物时，引物和模板的组合大约可扩增出10一100 个DNA片段。PCR扩增产物是在凝胶上进行分离 ，通过银染即可产生非常复杂带型。 1.2.1 SSR（Simple sequence Repeats, 简单重复序列） SSR 分子标记由Lit t M ,等于1989 年创建的。简单 重复序（SSR）也称微卫星DNA，其串联重复的核心序 列为1一6 bp，其中最常见是双核苷酸重复，即（CA) n 和（TG) n每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复 单位数目10一60个，其高度多态性主要来源于串联数目 的不同。SSR标记的基本原理：根据微卫星序列两端互 补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于 核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩 增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳， 根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。 SSR具有以下一些优点：（l）一般检测到 的是一个单一的多等位基因位点；微卫星呈 共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；所 需DNA量少。显然，在采用SSR技术分析微 卫星DNA多态性时必须知道重复序列两端的 DNA序列的信息。如不能直接从DNA数据库 查寻则首先必须对其进行测序。 1.2.2特定序列位点（STS） 特定序列位点(sequence tagged site， 缩写STS)是对由其特定引物序列所界定的一 类标记的统称。利用特异PCR技术的最大优点 是它产生的信息非常可靠，而不象RAPD、 AFLP和利用随机探针产生的RFLP存在某种模 糊性(如难以鉴别片段的来源) 这类分子标记主 要包括以下几种分子标记。 STMS lSTMS(Sequence tagged microsateUites)通常又称为 SSR，也可称为SSRP(Simple Sequence Repeat Polymorphisrms） 。引物根据与微卫星重复序列两翼 的特定短序列设计，用来扩增重复序列本身。由于重 复的长度变化极大，所以这是检测多态性的一种有效 方法。其特点包括：一般检测到的是一个单一的多等 位基因位点；共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子 ；得到的结果复性很高 STMS的发展和相近的分子标记种类 l(1)把与SSR互补的寡核苷酸作为多位点RFLP技术中 的探针； l(2)把与SSR互朴的寡核苷酸作为PCR引物(可单独作 引物或与随机引物配合使用)，扩增的是基因组DNA 的特定片段，即MP PCR和RAMPs： l(3)用标记的SSR探针与RAPD扩增片段杂交即 RAMPO或称为RAHM 或RAMS； l(4)用5 或3 端加锚的SSR 作引物(如GGCA )，即 ISSR。 DAMD (directed amplification of minisatellite region DNA) 直接用小卫星的核心序列作引物进行扩增。 ISTR (inverse sequencetagged repeat 这种技术与SPAR 技术也相近，也所用的 引物是在copia序列反向重复序列的基础上设 计的，扩增的是copia序列之间的DNA序列。 IFLP (intron fragmemt length polymorphism) l检测的对象是内含子的长度差异。 RAMPO (random amplified microsatellite polymorphism ) RAMPO的基本步骤是：先用一个单一的 随机引物(即RAPD引物)对基因组DNA扩增， 用电泳将扩增片段分开，然后，把凝胶转移到 尼龙膜上，使之与一个带有放射性标记(或其 它标记)的与SSR互补的寡核苷酸探针(如CA8 和GA8 )杂交，放射自显影后可得到新的多态 性类。 1.2.3 序列特异性扩增区 (Sequence characterized amplified regions SCAR) SCAR 标记是在RAPD技术的基础上发展起来的 。其基本步骤是：先作RAPD分析，然后把目标 RAP D片段(如与某目的基因连锁的R 片段)进行克 隆和测序，根据原RAPD片段两末端的序列设计特 定引物(一般比RAPD 引物长，通常24个碱基)，再 进行PCR特异扩增，这样就可把与原RAPD片段 相对应的单一位点鉴定出来。这样的位点就称为 SCAR。SCAR比RAPD和其它利用随机引物的方 法在基因定位和作图中的应用更好，因为它有更 高的可重复性(原因是使用的引物长)，标记是共显 性遗传的。SCAR标记方便、快捷、可靠，可以快 速检测大量个体，结果稳定性好，重现性高。 1.2.4 单引物扩增反应 (single primer amplification reaction SPAR ) SPAR技术与RAPD技术相似的是也只用一个引物 ，但SPAR分析中所用的引物不是随机的，而是在 SSR的基础上设计的，例如可能的序列是(TA)10或 (CGA)6。扩增的是SSR之间的DNA序列。又称为MP PCR(microsatelliteprimed PCR)。分析其多态 性。另外，还有一种与SPAR技术非常相似的标记技 术，即ISTR (Inverse Sequencetagged Repeat） 技术，ISTR所用的引物是在反向重复序列基础上设 计的，PCR扩增的是反向重复序列之间的DNA序列 。 1.2.5 DNA单链构象多态性 (Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP) SSCP是指等长的单链DNA因核昔酸序列的差 异而产生构象变异，在非变性聚丙烯酞胺中的表 现为电泳迁移率的差别。单链DNA构象分析对 DNA序列的改变非常敏感，常常一个碱基差别都 能显示出来。在SSCP分析中，利用PCR技术定 点扩增基因组DNA中某一目的片段，将扩增产物 进行变性处理，双链DNA分开成单链，再用非变 性聚丙烯酞胺凝胶电泳分离，根据条带位置变化 来判断目的片段中是否存在突变。SSCP结果判 定是通过多个样品之间对比，观察条带之间位置 改变，从而显示出不同生物个体的DNA特异性， 达到指纹分析目的。为了进一步提高SSCP的检出 率，可将SSCP分析与其它突变检测方法相结合。 其中与杂交双链分析（Heterocluplex analysis，Het ）法结合可以大大提高检出率。Het法是用探针与要 检测的单链DNA或RNA进行杂交，含有一对碱基对 错配的杂交链可以和完全互补的杂交链在非变性 PAG凝胶上通过电泳被分离开。对同一靶序列分别 进行SSCP和Het分析可以使点突变的检出率接 100%，而且实验简便。 应用 SSCP是基因突变检测的常用方法 ，广泛用于各类群体点突 变的检测 ,包括人类遗传病基因突变的探测、癌基因或抑 癌基因的突变探测等。在动物中 ,该技术也已应用于小鼠 、牛、猪等的多种基因的检测。 l1、SSCP可用于预筛选克隆文库。 l2、采用SSCP分析技术对人体内病毒作整体性的研究。 l3 、临床疾病基因突变分析检测脊髓性肌萎缩症基因 缺失 l4、分析检测细菌耐药性结核分枝杆菌 BFP药物敏感性 。 1.2.6双脱氧化指纹法 (Dideoxy Fingerprints，ddF) ddF是将双脱氧末端终止测序法与SSCP结合起 来的分析技术，对由双脱氧末端终止的长短不一 的单链DNA进行SSCP分析。如果目的片段存在一 个突变，则所有大于某一大小对应于突主变位置 的双脱氧终止片段无野生型系统，对于每一个突 有多次机会检测其迁移率改变，提高了检测突变 的效率。ddF方法克服了SSCP分析时因DNA长度 影响SSCP显示的困难，通过一种双脱氧核昔酸生 产特异性的单链DNA，使其中长度合适的DNA片 段显示SSCP改变。 2.1扩增片段长度多态性(AFLP) AFLP：特点是把RFI 和PCR结合了起来。 其基本步骤是：把DNA进行限制性内切酶酶切 ，然后选择特定的片段进行PCR 扩增(在所有 的限制性片段两端加上带有特定序列的“接头” ，用与接头互补的但3 端有几个随机选择的核 苷酸的引物进行特异PCR扩增，只有那些与3 端严格配对的片段才能得到扩增)，再在有高 分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射 性法、荧光法或银染染色法均可检测之。这种 技术又称为“选择性限制性片段扩增。 应用 AFLP广泛用于构建遗传连锁图谱、基因组研究 、遗传育种、亲子鉴定、遗传病诊断等领域。 AFLP 产生的多态性远远超过 RFLP 和 RAPD 等技术，因而被认为是指纹图谱技术中 多态性最丰富的一项技术。但该技术已申请专 利， 在生产及商业上的应用受到一定的限制 。 2.1 CAPS (Cleaved amplified polymorphic sequence) CAPS技术又可称为PCR- RFLP。所用的PCR 引物是针对特定的位点而设计的。其基本步骤是 ：先进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物用限制 性内切酶酶切，再用琼脂糖凝胶电泳将DNA片段 分开，用EB染色，观察。与RFLP 技术一样， CAPS技术检测的多态性其实是酶切片段大小的 差异。在酶切前进行RCR产物检测，其多态性称 为ALP。Neff et at，(1998)在此基础上又发展出 dCARS技术(derived CAPS)，这是检测单核苷酸 多态性的一种良好方法。 三、第三代分子标记技术：单核苷酸多态 性(SNP)技术 l单核苷酸多态性是指基因组DNA序列中由于单个核苷 酸（A，G，C，T）的突变引起多态性，它是一种单 核苷酸的变异。 lSNP是基因组中最简单、最常见的多态性形式，具有 很高的遗传稳定性。 l随着计算机和DNA芯片技术引入分子生物学领域，研 究者可同时对成千上万个克隆测序，用计算机分析数 据和显示最终结果。常用方法：1、随即扩增DNA（ RAPD）法；2、DNA芯片（DNA-chip）检测法 应用 遗传疾病研究 基因连锁和关联分析 药物基因组学 药物发现/药靶 农业/畜牧业遗传学 法医/个体识别 其它 四、其他几种分子杂交技术 1.MLPA标记 2.RGAs标记 3.SRAP标记 4.TRAP标记 1.MLPA：多重连接探针扩增技术 多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification ,MLPA）是一种针对待检 DNA序列进行定性和半定量分析的技术。 该技术高效、特异，在一次反应中可以 检测45个核苷酸序列拷贝数的改变，目 前已经应用于多个领域、多种疾病的研 究。 2.RGAs 标记( Resistance Gene Analogs ,抗病基因类似物) RGAs 是用基于抗病基因保守序列设计的 引物扩增基因组得到的抗病基因类似序列的新 型的分子标记。尽管基因间整个序列的同源性 不足于用RFL P 杂交检测,但抗病基因中存