基因表达与蛋白质纯.ppt

报告人报告人 曹雪曹雪 美美 基因表达基因表达与与蛋白质纯化蛋白质纯化 技术探讨技术探讨 读书报告 2010年9月30日 主主 要要 内内 容容 基因表达体系及优劣势基因表达体系及优劣势 大肠杆菌中表达蛋白质大肠杆菌中表达蛋白质 及纯化方法及纯化方法 可能碰到的问题可能碰到的问题 什么是基因表达呢？ 基因表达(gene expression)是指储存 遗传信息的基因经过一系列步骤表现出 其生物功能的整个过程。典型的基因表 达是基因经过转录、翻译，产生有生物 活性的蛋白质的过程。 基因表达体系基因表达体系 1. 1. 原核体系原核体系 2. 2. 真核体系真核体系 大肠杆菌大肠杆菌 ( (Escherichia coliEscherichia coli ) ) E . coli 是重要的原核表达体 系。在重组基因转化入E.coli 菌株以后 ，通过温度、诱导剂用量以及诱导时间 的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋 白质，将表达样品进行SDS-PAGE以检 测表达蛋白质 大肠杆菌大肠杆菌 ( (Escherichia coliEscherichia coli ) ) 遗传背景清楚，基因工程 操作方便，商品化表达载体 种类齐全，表达效率高； 基本不分泌蛋白，易形成 包含体(无正确折叠的立体结 构)，无加糖等修饰 枯草杆菌枯草杆菌 ( (Bacillus Bacillus subtilissubtilis) ) 分泌蛋白质能力强，一般有 天然立体结构； 无加糖修饰功能，培养液中 蛋白酶活性高，重组蛋白易受蛋 白酶的水解； 质粒不稳定，尚无商品化的 表达载体 其其 他他 乳酸菌 (Lactic acid bacteria) 沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) 苏云金杆菌 (Bacillus thuringiensis) 真核表达 真核细胞表达体系真核细胞表达体系 酵母细胞酵母细胞 昆虫细胞昆虫细胞 哺乳动物细胞哺乳动物细胞/ /组组 织织 植物细胞植物细胞/ /组织组织 酵母细胞酵母细胞 可生产分泌型蛋白；有天然立体结 构，有加糖修饰功能；可进行染色体整 合型基因表达; 糖链与哺乳动物加工的不一致，培 养上清多糖浓度高; 商品化表达体系： 酿酒酵母（Saccharomyce cerevisiae）; 毕氏酵母 (Pichia pastoris); 裂殖酵母（Schizosaccharomyce pombe） 昆虫细胞昆虫细胞 可以病毒感染的型式在成虫中 生产，也可在体外培养细胞中生产 蛋白; 适合分泌型和膜蛋白的表达， 有加糖修饰； 糖链有所区别，表达量有限； 作为药物宿主细胞未被FDA认 可 CHOCHO细胞细胞 可进行分泌表达，有天 然立体结构，加糖方式与 人体蛋白质完全一致； 表达量不够高，培养成 本较高 植物组织植物组织 植物可大面积种植，可以 廉价大规模生产； 转基因植物制作费时，表 达的组织特异性较难控制； 表达量较难提高，分离纯 化不方便 动物乳腺组织动物乳腺组织 分泌生产有天然立体结构 和活性的蛋白质至乳汁，产 量高，分离纯化方便，特别 适合药用蛋白的生产； 转基因动物制作花费巨大 ，实验周期长 原核表达与真核表达的区别原核表达与真核表达的区别 1 1、载体的区别、载体的区别 -整合机制整合机制 2 2、表达产物的区别表达产物的区别 -蛋白修饰的程蛋白修饰的程 度度 区别别 表达 类类型 载载体载载体举举例产产物 原核 表达 一般简单简单 ，质质 粒不整合到大 肠肠杆菌的DNA 而是自己复制 表达 pET 系列 产产物一级结级结 构 正确，但折叠 不一定正确 ， 没有糖基化和 磷酸化等修饰饰 真核 表达 一般由宿主细细 胞匹配的整合 机制的载载体整 合载载体在基因 组组上表达 酵母 Y 系 列 产产物一般修饰饰 的比较较好，糖 基化等完全， 更接近天然蛋 白 体系选择体系选择 研究基因功能研究基因功能: : 大肠杆菌大肠杆菌, , 裂殖酵母裂殖酵母, ,昆虫细胞昆虫细胞, , CHOCHO细胞细胞 多肽药物生产多肽药物生产: : 大肠杆菌大肠杆菌, , 毕氏酵母毕氏酵母, , CHOCHO细胞细胞, , 乳腺组织乳腺组织 疫苗疫苗: : 大肠杆菌大肠杆菌, , 酵母酵母, , 大多数沿用细胞培养产物进大多数沿用细胞培养产物进 行灭毒行灭毒 单抗生产单抗生产: : 杂交瘤细胞杂交瘤细胞 工业酶生产工业酶生产: : 各种微生物各种微生物 在大肠杆菌中表达在大肠杆菌中表达 外源基因外源基因 获得目的基因获得目的基因准备表达载体准备表达载体将目将目 的基因插入表达载体中（测序验证）的基因插入表达载体中（测序验证） 转化表达宿主菌转化表达宿主菌诱导靶蛋白的表诱导靶蛋白的表 达达表达蛋白的分析表达蛋白的分析扩增、纯化、扩增、纯化、 进一步检测进一步检测 原核表达一般程序 （一）获得目的基因（一）获得目的基因 1 1、通过、通过PCRPCR方法方法：以含目的基因的克隆质：以含目的基因的克隆质 粒为模板，按基因序列设计一对引物（在粒为模板，按基因序列设计一对引物（在 上游和下游引物分别引入不同的酶切位点上游和下游引物分别引入不同的酶切位点 ），），PCRPCR循环获得所需基因片段。循环获得所需基因片段。 2 2、通过、通过RT-PCRRT-PCR方法方法：用：用TRIzolTRIzol法从细胞法从细胞 或组织中提取总或组织中提取总RNARNA，以，以mRNAmRNA为模板，为模板， 逆转录形成逆转录形成cDNAcDNA第一链，以逆转录产物第一链，以逆转录产物 为模板进行为模板进行PCRPCR循环获得产物。循环获得产物。 原核表达操作步骤原核表达操作步骤 （二）构建重组表达载体（二）构建重组表达载体 1 1、载体酶切、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶：将表达质粒用限制性内切酶 （同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切 产物行琼脂糖电泳后，用胶回收产物行琼脂糖电泳后，用胶回收KitKit或冻融或冻融 法回收载体大片段。法回收载体大片段。 2 2、PCRPCR产物双酶切后回收，在产物双酶切后回收，在T4DNAT4DNA连连 接酶作用下连接入载体。接酶作用下连接入载体。 1、将连接产物转化大肠杆菌DH5，根据重组载 体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑 ，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均 正确，进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重 复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态 细胞。 （三）获得含重组表达质粒的表达菌种（三）获得含重组表达质粒的表达菌种 1 1、挑取含重组质粒的菌体单斑至、挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB2ml LB（含（含 Amp50g/mlAmp50g/ml）中）中3737过夜培养。过夜培养。 2 2、按、按1 1 5050比例稀释过夜菌，一般将比例稀释过夜菌，一般将1ml1ml菌加入到含菌加入到含 50mlLB50mlLB培养基的培养基的300ml300ml培养瓶中，培养瓶中，3737震荡培养至震荡培养至 OD600 OD600 0.4-1.00.4-1.0（最好（最好0.60.6，大约需，大约需3hr3hr）。）。 3 3、取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入、取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTGIPTG诱诱 导剂至终浓度导剂至终浓度0.4mM0.4mM作为实验组，两组继续作为实验组，两组继续3737震荡培震荡培 养养3hr3hr。 4 4、分别取菌体、分别取菌体1ml1ml，离心，离心12000g30s12000g30s收获沉淀，用收获沉淀，用100l 100l 1%SDS1%SDS重悬，混匀，重悬，混匀，707010min10min。 5 5、离心、离心12000g1min12000g1min，取上清作为样品，可做，取上清作为样品，可做SDS-SDS- PAGEPAGE等分析。等分析。 （四）诱（四）诱 导导 表表 达达 重组蛋白可在重组蛋白可在E.coliE.coli、酵母、昆虫和哺乳动物细、酵母、昆虫和哺乳动物细 胞等体系中得到高效表达，其表达形式一般可分胞等体系中得到高效表达，其表达形式一般可分 为：为： （1 1）细胞外的分泌表达；）细胞外的分泌表达； （2 2）细胞内可溶性表达；）细胞内可溶性表达； （3 3）细胞内不溶性表达，即产物以包涵体的形式）细胞内不溶性表达，即产物以包涵体的形式 存在。存在。 重组蛋白的表达形式重组蛋白的表达形式 SDS-PAGESDS-PAGE （秦 伟等，水稻密码子优化的cry2A* 基因在大肠杆菌中的表达及其表达产物的纯化，生物工程，2008 ） SDS-PAGESDS-PAGE （秦 伟等，水稻密码子优化的cry2A* 基因在大肠杆菌中的表达及其表达产物的纯化，生物工程，2008 ） SDS-PAGESDS-PAGE （秦 伟等，水稻密码子优化的cry2A* 基因在大肠杆菌中的表达及其表达产物的纯化，生物工程，2008 ） SDS-PAGESDS-PAGE （秦 伟等，水稻密码子优化的cry2A* 基因在大肠杆菌中的表达及其表达产物的纯化，生物工程，2008 ） SDS-PAGESDS-PAGE （秦 伟等，水稻密码子优化的cry2A* 基因在大肠杆菌中的表达及其表达产物的纯化，生物工程，2008 ） 按蛋白质类型分按蛋白质类型分 单纯表达单纯表达: : pJLApJLA系列系列, , 用用NcoI/NdeINcoI/NdeI导入导入AUGAUG的载体的载体 融合表达融合表达: : 融合各种融合各种tag, GST, CBD, MAL, GFP, etctag, GST, CBD, MAL, GFP, etc 分泌表达分泌表达: : pel/ompTpel/ompT分泌肽分泌肽 按启动子分按启动子分 laclac及衍生的及衍生的tactac , , trctrc, , pacpac, , racrac等启动子等启动子 IPTGIPTG诱导诱导 lamdalamda phage P phage P L L 和和P P R R 启动子启动子 热诱导热诱导 T7 T7 启动子启动子 IPTGIPTG诱导诱导 T5 T5 启动子启动子 IPTGIPTG诱导诱导 araara启动子启动子 阿拉伯糖诱导阿拉伯糖诱导 大肠杆菌表达载体分类大肠杆菌表达载体分类 pJLA50XpJLA50X系列系列; ; pcDNAIIpcDNAII; etc; etc pETpET系列系列 (T7 promoter, (T7 promoter, NovagenNovagen公司公司) ) pQEpQE系列系列 (T5 promoter, (T5 promoter, QiagenQiagen公司公司) ) pMALpMAL系列系列 ( (周质表达周质表达, , BioLabsBioLabs公司公司) ) pGEXpGEX系列系列 (GST(GST融合表达融合表达, Pharmacia, Pharmacia公司公司) ) pBADpBAD系列系列 ( (ArabinoseArabinose诱导型诱导型) ) 常用表达载体常用表达载体 pTYBpTYB系列系列 (CBD(CBD融合融合, , 可以自我切割可以自我切割, , BioLabsBioLabs) ) Protein A Protein A GSTGST（glutathione S-glutathione S-transferasetransferase） CBD (chitin-binding domain, CBD (chitin-binding domain, BioLabsBioLabs; ; cellulose-binding domain, cellulose-binding domain, NovagenNovagen) ) calmodulincalmodulin-binding domain, -binding domain, StratageneStratagene) ) MBP (maltose-binding protein)MBP (maltose-binding protein) GFP (green fluorescence protein)GFP (green fluorescence protein) ThioredoxinThioredoxin * *帮助二硫键形成帮助二硫键形成 DsbDsb ( (periplasmaperiplasma enzyme enzyme DsbADsbA, , DsbCDsbC) ) * * 二硫键的形成与二硫键的形成与 SUMO (small SUMO (small ubiquitinubiquitin-related modifier) -related modifier) KSI (KSI (ketosteroidketosteroid isomeraseisomerase) ) 基本上全部沉淀基本上全部沉淀 各种融合蛋白表达载体各种融合蛋白表达载体 帮助可溶化帮助分泌到周质可用亲和层析纯化 His-tag (His-tag (6-8 Histidine6-8 Histidine) ) T7-tag (T7-tag (MASMTGGQQMGMASMTGGQQMG) ) HSV-tag (HSV-tag (QPELAPEDPEDQPELAPEDPED) ) S-tag (S-tag (KETAAKFERQHMDSKETAAKFERQHMDS) ) VSV-G-tag (VSV-G-tag (TTDIEMNRLGKTTDIEMNRLGK) ) HA-tag (HA-tag (YPYDVPDYAYPYDVPDYA) ) Flag-tagFlag-tag ( (DYKDDDDKDYKDDDDK) ) MycMyc-tag (-tag (EQKLISEEDLEQKLISEEDL) ) 各种用于抗体识别的标记各种用于抗体识别的标记 DTT: DTT: inteinintein的的 CysCys 溴化溴化氰氰: : Met Met Thrombin: Thrombin: LVPRLVPR GS GS Factor Factor XaXa: : IEGRIEGR EnterokinaseEnterokinase: : DDDDKDDDDK PreScissionPreScissionTM TM protease: protease: LEVLFQ LEVLFQ GPGP GenenaseGenenase I I TM TM PGAAHY PGAAHY TEV protease:TEV protease: ENLYFQENLYFQ G G 融合蛋白的专一性切割融合蛋白的专一性切割 BL21(DE3)/pLysS : BL21(DE3)/pLysS : 自身表达自身表达T7 RNA polymeraseT7 RNA polymerase 适用适用pETpET系列等带系列等带T7T7启动子的载体启动子的载体 M15/SG13009 : M15/SG13009 : 自身表达自身表达T5 RNA polymeraseT5 RNA polymerase 适用适用pQEpQE系列等带系列等带T5T5启动子的载体启动子的载体 BL21BL21TrxBTrxB(DE3) : (DE3) : thioredoxinthioredoxin reductasereductase 突变突变 Origami : Origami : thioredoxinthioredoxin reductasereductase/glutathione /glutathione reductasereductase 双突变双突变 适合带适合带thioredoxinthioredoxin reductasereductase的的 融合表达载体融合表达载体, , 帮助形成更多的二硫键帮助形成更多的二硫键 BR21CodonPlusRIL: BR21CodonPlusRIL: 富含富含ATAT的真核生物基因的表达的真核生物基因的表达 BR21CodonPlusRP: BR21CodonPlusRP: 富含富含GCGC的真核生物基因的表达的真核生物基因的表达 特殊的表达用菌株特殊的表达用菌株 NovagenNovagen StratageneStratagene Invitrogen Invitrogen BioLabsBioLabs QiagenQiagen PharmaciaPharmacia PromegaPromega ClontechClontech RocheRoche GibcoGibco/BRL/BRL 重要的原核表达质粒提供商重要的原核表达质粒提供商 如果所表达的蛋白质有二硫键并如果所表达的蛋白质有二硫键并 需要正确的立体结构需要正确的立体结构, , 尽可能进行尽可能进行 可溶性表达可溶性表达; ; 如果所表达的蛋白质没有二硫键如果所表达的蛋白质没有二硫键 或只用来制备抗血清或只用来制备抗血清, , 采用包含体采用包含体 表达比较好表达比较好; ; 如果希望表达的多肽的分子量小如果希望表达的多肽的分子量小 于于10 kDa, 10 kDa, 一定要进行融合表达一定要进行融合表达 采用采用MBDMBD融合融合 采用采用GSTGST融合融合 采用采用CBDCBD融合融合 采用采用thioredoxinthioredoxin融合融合 采用采用OrigamiOrigami等宿主菌等宿主菌 降低菌体培养的速度降低菌体培养的速度 温度温度 (15-30(15-30), ), 降低转速降低转速 让表达产物可溶化让表达产物可溶化 采用采用CBDCBD融合融合 (pET36/37)(pET36/37) 采用采用DsbDsb融合融合 (pET39/40)(pET39/40) 采用带采用带pelB/ompTpelB/ompT引导肽的载体引导肽的载体 (pET12/20/22)(pET12/20/22) 采用带采用带MBDMBD融合融合 ( (pMALpMAL载体载体, , BiolabsBiolabs) ) 采用带采用带SUMOSUMO融合融合 (pET SUMO, Invitrogen)(pET SUMO, Invitrogen) 让让蛋白质分泌到间质去蛋白质分泌到间质去 纯化方便: 先用 EDTA/EDTA/蔗糖蔗糖 溶液处理, 然后 5 mM MgSO4 5 mM MgSO4 洗出 透析法透析法: : 简单简单; ; 但费时但费时, , 费缓冲液费缓冲液, , 蛋白质蛋白质 浓度不能过高浓度不能过高( (容易产生沉淀容易产生沉淀) ) 快速稀释法快速稀释法: : 最常用的小规模复性方法最常用的小规模复性方法; ; 但比较费时但比较费时, ,费缓冲液费缓冲液, , 蛋白质的浓度不能蛋白质的浓度不能 高高( (容易产生沉淀容易产生沉淀) ) 超滤透析法超滤透析法: : 比较省缓冲液比较省缓冲液, , 处理量大处理量大; ; 但费时但费时, , 要控制好蛋白质浓度要控制好蛋白质浓度 凝胶过滤法凝胶过滤法: : 快速快速, , 可重复性高可重复性高, , 不会产生不会产生 沉淀沉淀, , 操作复杂一点操作复杂一点 亲和层析复性法亲和层析复性法, , 水相二相法水相二相法, etc, etc 包含体来源蛋白质的复性包含体来源蛋白质的复性 原核表达优化策略如何避免包 涵体表达 n延长表达时间（过夜），低温培养（2530） n 诱导条件的优化 n 某些氨基酸的取代 n 共表达分子伴侣，硫氧还原蛋白的融合表达或与目标蛋白的共 表达 n 蛋白毒性，稳定性分析，更换宿主菌(利用硫氧还蛋白还原酶 缺陷菌株作为宿主菌)。 培养基中可加葡萄糖，通常用2%的浓度。 在培养过程中，要保持细菌摇瓶有良好的通气条件，充足的 氧流量可以减少包涵体的形成 重组蛋白的纯化方法重组蛋白的纯化方法 1. 1. 层析技术层析技术 2. 2. 电泳技术电泳技术 Ni-NTANi-NTA亲和层析亲和层析 His标签蛋白的纯化流程 表达量不够高；表达量不够高； 包含体在包含体在8M8M尿素中不能溶解；尿素中不能溶解； 重组蛋白在大肠杆菌中表达的分子量偏小；重组蛋白在大肠杆菌中表达的分子量偏小； 带带His-tagHis-tag重组蛋白不吸附到重组蛋白不吸附到Ni-chelatingNi-chelating树脂上；树脂上； Ni-chelatingNi-chelating分离纯化的效果不好；分离纯化的效果不好； GSTGST融合蛋白不吸附到融合蛋白不吸附到glutathione-glutathione-SepharoseSepharose上；上； 包含体来源的采用透析法或稀释法复性时全部沉淀；包含体来源的采用透析法或稀释法复性时全部沉淀； Ni-chelatingNi-chelating错用错用DTTDTT后发生黑色沉淀该怎么办？后发生黑色沉淀该怎么办？ 贵重的亲和层析树脂经常发生结块该怎么办？贵重的亲和层析树脂经常发生结块该怎么办？ 某些表达载体的表达效率在放大培养时无法提高某些表达载体的表达效率在放大培养时无法提高 经常碰到的问题经常碰到的问题 尝试不同表达载体尝试不同表达载体 ， 特别是特别是NN端有融合端有融合 蛋白的载体蛋白的载体 是不是忘了加还原剂（是不是忘了加还原剂（DTTDTT 或巯基乙醇）？或巯基乙醇）？ 是不是在是不是在2020冻存过？冻存过？ 用用4M4M盐酸胍试试盐酸胍试试 是不是酸性蛋白质？是不是酸性蛋白质？ 是不是蛋白质的合成提前中止了？是不是蛋白质的合成提前中止了？ （富（富 含含Arg, Ile, Arg, Ile, LeuLeu, Pro, Pro这几种氨基酸）这几种氨基酸） 可以尝试用可以尝试用BL21 BL21 CodonPlu