[高等教育]细胞工程复习精品.doc

生物工程(bioengineerinng)：是以生命科学为基础，利用生物体系和工程学原理生产生物制品和创造新物种的一门综合技术。细胞工程(cell engineering):是指应用细胞生物学和分子生物学的方法，通过类似于工程学的步骤，在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质以获得新型生物或特种细胞产物的一门综合性科学技术。愈伤组织(callus)：由外植体组织增生的细胞产生的一团不定型的疏散排列的薄壁组织。外植体(explant)：指植物组织培养中用来进行离体无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。脱分化（dedifferentiation）：又称去分化，在某些特定条件下，分化细胞的表型也不稳定，其基因活动模式也发生可逆的变化，细胞脱离原状态而回复到分生状态的变化过程。再分化(redifferentiation)：是指在离体条件下，无序生长的脱分化的细胞在适当条件下重新进入有序生长和分化状态的过程。 原代培养（primary culture）：在首次传代前的培养。又称初代培养。传代培养（passage culture/subculturing）：又称继代培养，是指原代培养的细胞继续转接培养的过程。看护培养（nursing culture）：是指用一块生长活跃的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖的一种培养方法。饲养层培养（feed layer culture）：是把处理过的（如X射线处理）无活性的或分裂很慢的细胞来饲养所需培养的细胞。植物组织培养（plant tissue culture）：是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞、胚胎、原生质体等培养在人工配置的培养基上，给予适当的培养条件，诱导产生愈伤组织，潜伏芽，或者长成新的完整植株的一种实验技术。 植物细胞培养：指在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中进行震荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群的一种技术。种质资源（germplasm resources）：又称遗传资源，指一切具有一定种质或基因并能并能繁殖的生物类型的总称，而种质是指决定生物遗传性状并将生物遗传信息从亲代传递给子代的遗传物质。 人工种子（artificial seed）：又称合成种子或体细胞种子，是指将植物离体培养的胚状体或芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中的类似种子的颗粒。悬浮培养（suspension culture）：将单个游离细胞或小细胞团悬浮在液体培养基中进行培养增殖的技术。细胞融合(cell fusion)：又称体细胞融合，使用自然或人工方法使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的技术。 原生质体(protoplast)：是去除细胞壁后裸露的球形细胞。体细胞杂交（somatic cell hybridization）：是指将不同来源的体细胞融合并使之分化再生，形成新品种的技术。染色体工程（chromosome ngineering）：是人们按照一定的设计，有计划地消减、添加或替换同种或异种染色体，从而达到定向改变遗传性状和选育新品种的一种技术。多倍体(polyploid)：指体细胞中含有超过正常染色体组数的个体，即具有三套以上染色体组的细胞或个体。 同源多倍体：如果多倍体的染色体来自于同一物种或在原有染色组的基础上加倍而成的个体。异源多倍体：如果多倍体的染色体来源于不同物种的个体。单倍体(haploid)：是细胞中含有正常体细胞一半染色体数的个体，即具有配子染色体组的个体。动物细胞培养(animal cell culture)：模拟动物体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞分裂增殖的一种技术，是动物细胞工程的基础。杂交瘤细胞(hybridoma cell)：在制备单克隆抗体过程中，用骨髓瘤细胞和B细胞融合而成的细胞。单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）：经过免疫的哺乳类动物单一的B淋巴细胞可以分泌单一性抗体，这种具有特异性的、同质性的抗体就称为。胚胎工程（embryo technology）：指所有对配子和胚胎进行人为地干预，使其环境因素、发育模式或局部组织功能发生质和量的变化，获得所需的成体动物的技术。体外受精(in vitro fertilization,IVF)：将哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。核移植(nuclear transfer)：利用显微操作技术将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去核成熟卵细胞内，重新组成重构胚并使之发育成成体动物的技术。多倍体动物(polyploidy animal)：指细胞中含有超过正常体细胞染色体组数的动物个体。转基因动物(transgenic animal)：指在基因组内稳定地整合外源基因，并且外源基因可以稳定地遗传给后代的基因工程动物。 干细胞(stem cell,SC)：一类具有自我更新和分化潜能的细胞，即起源细胞。内细胞团(embryoblast)：又称胚细胞，是一团位于哺乳动物初期胚胎中的一个细胞团块。组织工程(tissue engineering)：利用生命科学、医学、工程学原理与技术，单独或组合地利用细胞、生物材料、细胞因子实现组织修复或器官再生的一门技术。种子细胞(ssed cell)：是组织修复或器官再生的细胞材料，细胞必须能不断进行细胞分裂，且必须能被调控分化成特定的组织细胞。胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC）：是从着床前胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞。成体干细胞（adult stem cell,ASC）：是成体组织内具有更新和进一步分化潜能的细胞。1.简述植物组织培养的一般过程【 1）培养材料的采集：植物具有全能性的细胞有三类：受精卵、发育中的发生组织细胞、雌雄配子及单倍体细胞。在快速繁殖中最常用的材料是茎尖，通常切块在0.5cm左右，对于木本花卉来说，针叶树种多采用种子内的子叶或胚轴，草本植物多采用茎尖。2）培养材料的消毒：自来水、蒸馏水、消毒刀切成小块，无菌环境下70%酒精，漂白粉饱和液。3）制备外植体:消毒刀切成0.20.5cm小片4）接种和培养 接种、封口、温度25 5）培养物的增殖：继代培养，增殖在分化培养基上6）根的诱导：生根培养基上进行生根培养7)炼苗移栽 8）再生植株的鉴定:用细胞学或生态学等方法检查再生植株是否变异】2.组织培养与细胞培养区别与联系【区别组织培养：从机体内取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在机体外进行培养，使之生存或成长成组织；细胞培养：指植物细胞在体外条件下的存活或生长，此时细胞不长成组织。组织培养用于植物快速繁殖的组培技术，细胞培养主要用以生产次生代谢产物为目的大规模细胞培养技术。联系：植物细胞培养的一些技术是建立在组织培养基础上的。3.植物增殖的方式有几种，分别有什么特点。【1）腋芽增殖：培养方法简单，能高度保持遗传稳定性，能长期继代繁殖，一般不需要添加外源激素。缺点：繁殖系数较小2）不定芽繁殖：繁殖系数高，遗传稳定性好，但继代次数有限，进行生根培养时才能形成真正的植株。缺点：传代次数受限3）胚状体增殖：增长率高，双极性免去生根环节，胚状体休眠的诱导难以把握，一般可以做人工种子。缺点：胚状体的休眠难以把握，成苗率不高4)愈伤组织增殖：成功率高，繁殖系数大。缺点：遗传稳定性差，对品种要求遗传稳定性高的作物一般不采用这种快速繁殖。】4.热处理脱毒与茎尖脱毒的原理及其技术。（一）热处理脱毒原理1)病毒进入植物细胞后，随植物细胞的DNA一起复制，热处理不能杀死病毒，只能转化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，而失去侵染能力2）热处理是一种物理效应，加重植物细胞的分裂，使植物细胞在与病毒繁殖中取胜。热处理脱毒方法温水浸湿处理：材料置于50左右热水中浸渍几十分钟到数小时。特点：简单易行，成本低，但易使材料受伤热空气处理：将植物用3540的热空气处理24周或更长时间。特点：损伤较小，操作简便，须严格控制温度时间。（二）茎尖脱毒：病毒在植物体分布不均一，在植物体内传播主要以维管束为主，越接近生长点约0.11.0mm病毒浓度越稀。技术关键：1）诊断病毒种类及分布2）母体植物的选择与预处理3）茎尖剥离4）脱毒苗的保存和繁殖。5.影响茎尖脱毒的因素【母体材料病毒侵染的程度：单一病毒感染的植物脱毒效果好。外植体的生理状态：生长旺盛的芽比休眠芽好起始培养的珠尖大小：不带叶原基的生长点培养脱毒效果最好。】6. 超低温保存的原理（方法）【超低温保存一般是指在低于80度的超低温环境下保存种质资源。而液氮为196度，此时几乎所有的细胞代谢活动停止，仅保存细胞活力和形态分生的潜能，当解冻后能恢复其再生能力（低温能抑制生物细胞的生化活动）】7.简述理想人工种子的要求【人工种子主要由人工种皮、人工胚乳和胚状体三部分构成，而人工种子的制作过程中包埋是非常重要的环节。因此对于人工胚乳，理想的包埋介质应满足1)对所包埋的胚乳无伤害2）有足够的柔软性，可以保护胚乳，允许其发育。3）具有一定的硬度，避免运输和操作过程中的伤害4）有穿透性，传递细胞生长的所需的营养，并能容纳其他附加成分，杀虫剂，防腐剂等5）可以用现有的温室和农机器械进行播种。合适的外植体的愈伤组织经培养得到的胚状体也很重要】8.简述植物单细胞制备方法的优缺点【1）机械法：优点：操作简单，能够获得游离的单个细胞，细胞完整性较好。缺点：效率低，获得细胞数量有限。2）酶解法：优点：用果胶酶处理细胞壁，将细胞释放出来，容易获得大量单细胞。缺点：酶的成本高，且对细胞活性有一定破坏。3）愈伤组织诱导法：优点：通过愈伤组织反复的几代培养，使细胞之间的结构非常松散，便于得到单个细胞。缺点：操作复杂，且添加酶对细胞活性有一定影响】9.简述理想的植物细胞悬浮体系的要求【1）悬浮培养物分散良好，细胞团较小。2）均一性好，细胞形状和细胞大小大致相同以及培养基清澈透亮。3）细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般为23天，甚至更短时间便可以增加一倍】10.简述原生质体分离纯化的方法。分离1）机械法缺点得到的原生质体有限只限于能够广泛发生质壁分离的组织不能从成熟的和分生细胞分离原生质体。优点：得到原生质体完好无损2）酶解法：用纤维素酶，果胶酶等降解细胞壁。缺点：酶会对原生质体产生一些影响。优点能够容易地大量地得到原生质体条件温和，完整性好，有活力。几乎可以从任何组织分离出原生质体 纯化方法沉降漂浮法：滤出液置于离心管中低速离心，原生质体将沉于管底，细胞碎屑浮于上清液中。弃上清，冲洗液冲洗，离心收集底部的原生质体漂浮法：利用比重大于原生质体的高渗溶液，在溶液中漂浮，用吸管收集过滤离心法：采用40100um的网筛过滤细胞混合液，除去未消化的细胞，细胞团，碎屑，然后在适当的溶剂内低速离心，弃上清，取底部的原生质体界面法：是原生质体处于两界面之间，从而获取一定量得原生质体。11.细胞融合的主要方法有哪些，各有什么特点。（1）生物方法（如病毒诱导融合法）优点：融合率较高，对各种动物细胞都适宜，且仙台病毒能在鸡胚中大量繁殖，容易培养。缺点：操作繁琐，融合率不高，病毒能对所融合的细胞产生影响，具有危险性（目前较少使用）。（2）化学方法（如聚乙二醇PEG诱导融合法）优点：融合成本低，勿用特殊设备，融合子产生的异核率较高，融合过程不受物种限制。缺点：融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。（3）物理方法（如电场诱导融合法）优点：融合率高，达70%80%甚至100%，不存在对细胞的毒害问题，可在显微镜下定向诱导，可直接挑选杂种细胞，操作简便。缺点：需要特殊的仪器设备且仪器昂贵。12.怎样选择融合后杂合的细胞【抗药性筛选法：利用细胞对药物敏感性差异筛选融合细胞营养互补筛选法：细胞在缺乏一种或几种营养成分时不能生长繁殖即属于营养缺陷型细胞。利用两亲本细胞营养互补可以筛选融合细胞物理特性筛选法：利用细胞在形态、大小、颜色上的差别可以在倒置显微镜下用微管将融合细胞吸取挑选出来，也可以用采用离心的方法分离融合细胞荧光标记法:对于形态、颜色上都不能区分的情况，可以采用不同的荧光染料（例如发光绿色荧光的异硫氰酸荧光素和发红色荧光的碱性蕊香红荧光素）分别标记两个亲本细胞，这样融合细胞内存在两种荧光标记，可以在荧光显微镜下挑选分离或用流式细胞仪分离】13.人工诱导多倍体植物形成的方法【（一）生物学方法体细胞杂交法:利用染色体加倍个体再与未加倍个体杂交培育出多倍体植物（如，无子西瓜的培育）胚乳培养法：胚乳具细胞全能性，经培养可得到三倍体植株，但在发育过程中会发生倍性改变（二）化学方法：利用一些化学物质可以阻止第二极体的排出或受精卵的有丝分裂而产生三倍体或四倍体细胞松驰素 B：抑制肌动蛋白聚合成微丝，从而抑制细胞质分裂秋水仙素：可抑制细胞分裂中纺锤丝的形成，因而可以抑制有丝分裂】14.简述原代培养和传代培养的基本过程【原代培养取出动物组织，用尖嘴剪刀将组织剪碎，用Hanks液冲洗下剪刀上碎片消化，加入酶液消化，可加Hanks液，目的为了稀释酶浓度离心去除未消化的细胞，碎片制备细胞悬液，并计数，控制生长密度4悬液移入培养瓶接种传代培养：1，吸出瓶内旧培养液。2，加入胰蛋白酶和EDTA混合液盖满瓶底。3,25分钟后检查，如有细胞间隙变大或者细胞质回缩现象，停止消化。4，吸出消化液，加入Hanks液，轻轻转动，避免细胞流失，吸取残余消化液。如果单用胰蛋白酶，可以直接加入培养液。5，用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落制成悬液，计数后记录其浓度。6，从新接种培养。】15.简述体外受精的一般过程【（一）卵母细胞的采集和成熟培养超速排卵技术：用促性腺激素处理，促雌性动物排卵，从输卵管中冲取卵子直接获取法；从活体动物卵巢中采集卵母细胞，在体外经人工培养为成熟的卵子（二）精子的采集和获能：精子的采集一般采用“上浮分离法”，精子获能可采用添加诱导精子获能物质，如Ca2+ 血清蛋白 肝素）（三）体外受精获能的精子和培养成熟的卵子，在受精溶液中完成受精过程在人工条件下，将精子注入到成熟的卵子中，完成人工授精（四）受精卵的发育与体外培养：受精卵需在体外培养发育一段时间才能移植至受体子宫】16.常用的多倍体动物的培育方法有哪些【物理法：1)温度休克法：用略高于或略低于致死温度的冷或热休克来诱导三倍体或四倍体的方法。包括冷休克法和热休克，略高于致死低温为冷休克，温度在05；温度略低于致死高温为热休克，温度在30左右。2）水静压法：采用较高的水静压，抑制卵母细胞第二极体的释放或细胞分裂产生多倍体。此方法有诱导率高，时间短，对受精卵损害小，成活率高的特点。3）还有机械创伤法，电离辐射法，离心法等，但是损害大，不宜使用。化学法：用某些化学药品诱导多倍体（细胞松驰素 B：抑制肌动蛋白聚合成微丝，从而抑制细胞质分裂）。生物学法：主要指远缘杂交，利用染色体加倍个体与未加倍个体杂交产下多倍体】17.胚胎干细胞体外培养的关键技术【特殊培养基和消化液：用高糖和谷氨酰胺的DMEM培养基，葡萄糖浓度一般在4500mg/L以上，添加15%的胎牛血清添加抑制细胞分化的-巯基乙醇，消化液使用消化液中胰蛋白酶和EDTA的浓度比一般动物细胞高饲养层细胞：一方面提供物理支持，另一方面饲养层具有促进细胞增殖和抑制其分化功能。常用饲养层细胞有STO(小鼠胎儿成纤维细胞) PMEE条件培养基和细胞因子：在基础培养基中按一定比例添加了抑制因子和细胞因子，如白细胞因子（LIF）可抑制细胞生长和分化】18.鉴定胚胎干细胞【碱性磷酸酶活性高端粒酶活性高细胞膜表面有特殊的标记能分化成三个胚层的细胞可诱导分化为各种成体干细胞】 19.组织工程三要素【种子细胞：包括干细（胚胎干细胞、成体干细胞）、组织来源的体细胞支架材料：指替代细胞外基质的生物医学材料，具有良好的生物亲和性、生物可降解性、合适的三维立体结构、支架强度影响因子：物理因子主要是应力的作用；生长因子是通过与细胞膜受体结合，调节细胞生长与其他细胞功能等多效应的多肽类物质】20.举例说明组织工程产品的技术路线【将体内培养的细胞接种到受损部位生长进行原位修复将支架材料与细胞混合，移植到受损部位，随着细胞的生长，支架材料的降解而取代或填补受损部位使用可降解三围多孔材料，接种培养细胞，体外再生组织或器官，移植替换】21.单克隆抗体制备的一般过程【亲本细胞的选择(骨髓瘤细胞：不分泌抗体，多用BALB/C小鼠的骨髓瘤细胞，淋巴细胞：经免疫处理的淋巴细胞)细胞融合（用化学法：PEG结合高Ca2+诱导剂）筛选a在HAT培养基中筛选杂交细胞（添加饲养层细胞）b后改用HT培养基c载改用完全RPMI 1640培养液杂交瘤细胞的克隆化培养，方法是有限稀释法（添加饲养层细胞）鉴定;分2部分a杂交瘤细胞的鉴定：染色体数目，既可作为鉴定客观指标，又可了解分泌抗体能力）b抗体性状的鉴定：抗体的特异性，抗体的效价大量生产】一、怎样看待试管婴儿带来的伦理学问题？（一）体外受精技术,俗称“试管婴儿”，是从卵巢内取出几个卵子，在实验室里让它们与男方的精子结合，形成胚胎，然后转移胚胎到子宫内，使之在妈妈的子宫内着床，妊娠。正常的受孕需要精子和卵子在输卵管相遇，二者结合，形成受精卵，然后受精卵再回到子宫腔，继续妊娠。所以“试管婴儿”可以简单地理解成由于实验室的试管代替了输卵管的功能而称为“试管婴儿”。（二）不符合伦理道德(1)把试管婴儿当作人体零配件工厂,是对生命的不尊敬(2)早期的生命也有活下去的权利,抛弃或杀死多余的胚胎,无异于”谋杀”(3)有人会滥用设计试管婴儿技术,而设计婴儿性别。（三）符合伦理道德(1)设计试管婴儿是为了救人,是救治患者的最好,最快捷的办法之一(2)提供骨髓中造血干细胞并不会对试管婴儿造成损伤(3)脐带血乃试管婴儿的”身外之物”.（四）中国政府的观点 中国卫生部在体外受精-胚胎移植及其衍生技术规范中规定,实施体外受精-胚胎移植及其衍生技术必须获得卫生部批准书。二、怎样看待体细胞克隆技术？（一）体细胞克隆技术是将动物体细胞经过抑制培养，使其处于休眠状态，利用细胞核移殖技术将其导入去核卵母细胞，发育成胚胎后移植至受体，妊娠产仔，克隆出成体细胞。（二）不符合伦理道德：生殖性克隆是指出于生殖目的使用克隆技术在实验室制造人类胚胎，然后将胚胎置入人类子宫发育成胎儿或婴儿的过程 1)克隆技术尚不成熟，还处于探索阶段，一般克隆动物夭折率高 2)克隆人严重违反了人类伦理道德3)克隆人冲击了现有的婚姻家庭和两性关系等传统的伦理道德观念4)克隆人是制造在心理上和社会地位上都不健全的人。（三）符合伦理道德：治疗性克隆是指把克隆出来的组织或者器官用于治疗疾病，这种用于医疗目的，在实验室使用克隆技术制造胚胎的过程被称为“治疗性克隆”。在合适的条件下，使其发育成为人体的任何一个器官，包括大脑、肌肉、血液和神经，这些器官组织将用于医疗。 （四）中国政府的观点：禁止生殖性克隆人,不反对治疗性克隆.三、怎样正确看待转基因动物？基因重组打破了物种间的界限，打扰了自然进化历程，改变了生态系统结构，破坏了生态系统的稳定性，这对人类可能是个灾难 转基因生物具有新性状，其适合度和竞争力增加，可能会导致本来就弱的濒危生物更快的从地球上消失 转基因数目的增加会对生物多样性，群落结构形成威胁 新性状的转基因生物如果大量回归自然界，有可能会影响到生态系统中能量的流动和物质循环 重组微生物降解的产物是否有害 转基因食品是否会影响人类的健康还不确定。1、植物脱毒技术方法（热处理，茎尖培养、愈伤组织、微体嫁接离体、珠心组织培养法、）2、愈伤组织培养获得无病毒植株的原因（A病毒在植株体内不同器官或同一器官不同组织中分化不均匀，那些无病毒组织产生的愈伤组织就是获得无病毒组织的基础B有些愈伤组织细胞病毒浓度较低，在愈伤组织快速分裂过程中，病毒的复制能力弱C愈伤组织产生抗性变异细胞） 3、单细胞制备方法（机械法 酶法（果胶酶） 愈伤组织诱导法）4、细胞株保存方法（继代培养保存法、低温保存法、冰箱保存）5、细胞同步化培养（体积选择法、冷处理法、饥饿法、抑制法（有丝分裂抑制）6、细胞悬浮系统（机械搅拌式、气压搅拌式培养体系、旋转式培养体系）7、原生质体分离方法（机械法（先使细胞壁分离在用刀切）、酶解法（纤维素酶，果胶酶）8、原生质体纯化方法（过滤离心法漂浮法沉降法和漂浮法结合界面法）9原生质体活力测定（染色法荧光素双醋酸盐（FDA）法能发荧光的为活性；酚藏花红染料法具有活性原生质体不着色） 或细胞10、细胞融合步骤（两原生质体相互靠近质膜融合形成细胞桥胞质渗透细胞核融合）11、细胞融合方法（生物法仙台病毒、物理法电融合诱导、化学法NaNo3诱导融合高ph的高浓度Ca2+离子的聚乙二醇诱导融合）12、多倍体物种鉴定（核体积测量（细胞核大小与染色体数目成比例）、染色体计数法、DNA含量测定）13、贴附型细胞【成纤维型细胞（细胞大致成梭形或不规则形贴壁后成长梭形，胞质外伸出2-3长短不同的突起细胞之间排列疏散有较大的细胞间隙，起源于中胚层）上皮型细胞：扁平状，形态较为规则，贴壁后呈三角形及不规则扁平的多角形，中央有扁圆形核生长时彼此紧密链接成单层细胞，起源于内胚层和外胚层，例如皮肤的表皮细胞，消化管游走型细胞：具有类似巨噬细胞的特性在支持物上分散生长，一般不连接成片、形成菌落;细胞质常伸去伪足和突起，细胞不稳定，外形不规则且不断变化。这种细胞形态主要是具有吞噬细胞的单核巨噬细胞系统的细胞。例如：颗