开题报告-不同后处理对蝉花孢梗束腺苷含量变化的研究.docx

滁州学院本科毕业设计（论文）开题报告表课题题目 不同干燥方式对蝉花孢梗束中主要活性成分的影响学生姓名 张相心 所学专业 农产品质量与安全 导师姓名 于士军 报告日期 2014-10-26 滁州学院教务处制关于本科毕业设计（论文）开题报告的规定为切实做好本科毕业设计（论文）的开题报告工作，保证论文质量，特作如下规定：一、开题报告是本科毕业设计（论文）的必经过程，所有本科生在写作毕业设计（论文）之前都必须作开题报告。二、开题报告主要检验学生对专业知识的驾驭能力和研究能力，考察写作论文的准备工作是否深入细致，包括选题是否恰当，资料占有是否翔实、全面，对国内外的研究状况是否了解，本人的研究是否具有创新性等。三、毕业设计（论文）开题报告前，学生必须根据所学专业培养目标，与教师双向选择后确定选题，根据任务书广泛查阅文献，深入调查，收集资料，制定研究方案，在此基础上撰写开题报告。四、学生设计（论文）开题前需认真填写开题报告表，并向导师提出申请，由毕业设计（论文）指导小组负责开题报告的评议。五、毕业设计（论文）指导小组应当对开题报告进行认真评议，主要评议论文选题是否恰当，研究设想是否合理、可行，研究内容与方法是否具有开拓性、创新性，是否可以开始进行论文写作等。评议结果分为“合格”和“不合格”两种，学生开题报告评议结果须为“合格”方可开始论文写作。毕业设计（论文）指导小组不得少于3人六、开题报告表应送交所在院(部)保存。七、表中各项可自行加页题目不同干燥方式对蝉花孢梗束中主要活性成分的影响指导小组成员姓名专业技术职务或职称签字董艺凝副教授陈志宏助教苗文娟助教周佳讲师李双芳助教研究现状、选题意义、研究方法、研究内容和主要参考文献研究现状、选题意义、研究方法、研究内容和主要参考文献研究现状、选题意义、研究方法、研究内容和主要参考文献研究现状、选题意义、研究方法、研究内容和主要参考文献研究现状、选题意义、研究方法、研究内容和主要参考文献研究现状、选题意义、研究方法、研究内容和主要参考文献研究现状：虫草是真菌寄生于昆虫，把虫体变成充满菌丝的僵虫，从僵虫前端生出有柄头状或棍棒状的子座。 目前，世界上已发现的虫草有557种1，其中冬虫夏草最为出名。蛹虫草和广东虫草已经被卫生部批准作为新资源食品2,3。古代中国人对虫草菌早有认识。日本学者认为中国对虫草的认知应在至少3000 年前。而这种“胡蜂长树”的描绘比段成式在酉阳杂俎（836 年）所记“菌生于蜂”要晚920 年，比北宋唐慎微在证类本草（1098）中对“知了生花”的描绘也晚了658 年。我国最早的药物学专著神农本草经在2000年前就记载了白僵蚕，其病原球孢白僵菌（Beauveria bassiana）的有性阶段叫球孢虫草(Cordyceps bassiana)4。蝉花又名虫花、蝉草、蝉茸等，是由虫草科真菌Isaria cicadae感染蝉科山蝉、蝼蛄、黑蚱及竹蝉等幼虫，于虫体头部形成花蕾状子座，故名蝉花5。蝉花之名最早见于南北朝刘宋时代之雷公炮制论中记载：凡使蝉花要白花全者。收得后于屋下悬干，去甲土后用浆水煮一日，至夜焙干，研细用之4。蝉花入药已有一千多年的历史。现代医学研究表明，蝉花具有显著的免疫调节、抗肿瘤和改善肾功能等作用。Cheng等对蝉花胞内多糖的免疫活性进行了研究，结果表明蝉花多糖对体外巨噬细胞增殖有直接的免疫刺激作用，可剂量依赖地刺激NO的产生6。Fujita 等从蝉花孢梗束分离得到的ISP-1有显著的免疫抑制活性7。Ukai等从蝉花中分离出了一个半乳甘露聚糖C-3（Galactomannan），以20mg/kg 的剂量对小鼠S180肉瘤进行抗肿瘤研究，结果抑制率为47%8。Takano等从金蝉花发酵液中分离出一种可以促进Th1免疫反应的蛋白多糖该多糖可以增加大鼠派氏集合淋巴结细胞中白介素-2和干扰素-的浓度9。 2010年诺华公司（Novartis）在蝉花的免疫调节活性物质多球壳菌素（ISP-1）基础上开发的治疗多发性硬化症的药物Fingolimod（商品名：Gilenya）获得美国FDA的认证10,11。同时，蝉花还有含有丰富的营养成分。张红霞对采自浙江宁海的天然蝉花及分离菌种在麦仁培养基上的发酵培养的蝉花子实体进行分析；结果表明，天然蝉花中粗蛋白含量高达39.79%，人工培养的蝉花子实体中粗蛋白含量31.18%12。滕晔等对浙江湖州的野生金蝉花及人工培养的蝉花进行了氨基酸成分的分析，结果表明，除丙氨酸外，液体发酵获得的蝉花与野生蝉花所有的氨基酸种类均一样，且多种氨基酸的含量高出野生蝉花13。此外，高增平等对天然蝉花（采自杭州岳王庙）中无机元素进行了全面分析测定，并跟冬虫夏草进行了比较，蝉花含有丰富的矿物元素，其中铁（Fe）、锌（Zn）含量特别高，分别占各自营养素参考值1527%和206%，属高铁和富含锌的食品14。腺苷是一种嘌呤核苷，各由核糖（呋喃核糖）与腺嘌呤的一部分组成，中间-N9-配糖键（-N9-glycosidic bond）连结，分子式：C10H13N5O4，分子量：267.24，白色或类白色结晶性粉末，熔点：233238，比旋度：68.072.0。腺苷具有多种生物活性，涉及到中枢神经系统中不同生理过程的调节，能抑制中枢神经元的兴奋性，可以扩张冠状及周围血管、增加冠状动脉血流量、降低血压、减慢心率等作用，腺苷还具有抗血小板聚集、抗辐射和抗肿瘤等，因此腺苷的含量是评价各种虫草内在质量的主要指标。温鲁等（2006）比较了蝉花和冬虫夏草中的腺苷含量，蝉花为1.90 mg/g，约为冬虫夏草的4倍15。麦角甾醇又称麦角固醇，一种重要的植物甾醇，分子式：C2H44O，分子量396.66，熔点160163是脂溶性维生素D2的前身，也是生产甾体激素药物的重要原料。当麦角甾醇受到紫外线照射时可转化成维生素D2，维生素D2具有防止软骨病的作用。麦角甾醇是一种重要的医药化工原料用于可的松、黄体酮等药物的生产14-15。目前已知麦角甾醇是大多数子囊菌、担子菌种和半知菌中最主要的甾醇17。蝉花中也含有较多的麦角甾醇。蝉花中含有较多的甘露醇，甘露醇是山梨糖醇的同分异构体，两种醇类物质的二号碳原子上羟基朝向不同，分子式是C6H14O6,分子量为182.17.易溶于水，为白色透明固体，有类似于甘蔗的甜味。D-甘露醇即虫草酸是虫草的功效成分之一，具有镇咳、祛痰、平喘等作用；能够清除人体内强毒性的羟自由基；降低颅内压、眼内压；是良好的利尿剂、食品甜味剂，并且对食品具有防粘作用；具有热量低的特点，可以开发为糖尿病患者的食品16。选题意义：蝉花是一种使用历史悠久的传统中药材，目前有多家高校和研究所对蝉花展开了广泛而深入的研究，希望开发出更多的虫草制品。本论文拟研究不同温度干燥蝉花孢梗束样品中的腺苷、麦角甾醇和甘露醇含量的影响，探讨不同温度干燥处理后蝉花孢梗束中腺苷、麦角甾醇和甘露醇含量及变化的原因。探索蝉花孢梗束干燥的最佳工艺，以期为今后的蝉花孢梗束加工及其他虫草制品的干燥加工工艺提供理论支持。研究方法2.1腺苷供试样品的制备CK：新鲜蝉花孢梗束采收后用抽湿机抽湿24小时后，再在60烘箱中烘干：60干燥：新鲜蝉花孢梗束采收后直接置于60烘箱中烘干；80干燥：新鲜蝉花孢梗束采收后直接置于80烘箱中烘干；108干燥：新鲜蝉花孢梗束采收后直接置于108烘箱中烘干；蒸煮后烘干：新鲜蝉花孢梗束采收后在100的蒸汽中蒸10min后，再置于60烘箱中烘干。（1）对照品溶液的制备 精密称取10mg腺苷对照品，置于10mL容量瓶中，加超纯水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得1mg/ml对照品。（2）腺苷供试品溶液的制备 取0.1g蝉花子实体供试样品粉末，精密称定，置10mL塞具试管中，精密加入5mL去离子水，密塞，25超声（40KHz）处理30分钟，取上清液，经0.22m微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。各条件下的样品分别重复制作5次，编号备用。2.2甘露醇供试样品溶液的配制精确称取供试样品1g置于100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。100水浴2h，过滤，用蒸馏水洗涤残渣；将滤液和洗液合并，并定容至200mL，备用。2.3麦角甾醇供试样品的制备精确称取供试样品1g，置于50mL容量瓶中，加CHCl3至刻度，超声波处理30min，放冷，再称定重量，用CHCl3补足减少的重量，摇匀，用微量移液器量取1mL，置于Eppendorf管内，5000rpm离心5min，用微量移液器小心吸取上清液放置于新的Eppendorf内，备用。2.4色谱条件色谱柱：XBridgeC18色谱柱(Water，4.6mm250mm，5m)； XBridgeC18保护住(Water，4.6mm20mm，5m)；流动相：乙腈-0.04mol/L磷酸二氢钾（5：95）；流速：0.8mL/min；检测波长：280nm；柱温：25；进样量：20l定量环满环进样2.5 水分含量的测定将各样品取出少量放入水分活度仪托盘中小心涂抹均匀后测量，待样品的质量持续30秒不再减少后记录样品的水分含量。每种样品做5组平行实验。2.6腺苷含量的测定（1） 腺苷标准曲线的制定精密称取腺苷对照品（Adenine99%）10mg，加超纯水配制成浓度为2.5g/ml、 5g/ml、 20g/ml、30g/m l、40g/ml、50g/ml、的对照品系列溶液6份溶液，精密吸取对照品系列溶液各20微升注入高效液相色谱，按“3.2”项下色谱测定峰面积积分值。根据样品浓度和峰面积来制定标准曲线。以对照品溶液浓度（g/ml）为横坐标X，峰面积积分值（微伏秒）为纵坐标Y。（2）仪器精密度实验取浓度为5g/ml对照品溶液，按照“3.2”项下色谱条件连续进样6次。根据测的结果，用腺苷峰面积和腺苷含量的浓度计算出RSD ，根据RSD与 2%的大小关系，来说明仪器精密度的实验结果是否良好，符合精密度要求。（3）重复性实验取0.1g蝉花孢梗束供试样品粉末（对照品）6份，精密称定，按“3.1.1”项供试品溶液的制备方法，制成同一浓度的供试品溶液6份，分别精密吸取各供试拼溶液1mL，各精确加入超纯水1mL制成2倍供试品稀释液，混匀，备用。按“3.2”项下色谱条件分别检测，测定峰面积积分值，由回归方程得腺苷待测液浓度，根据公式1得到供试品腺苷含量（mg/g）。根据腺苷含量平均值（n=6），求出RSD%并与3%比较，来说明重复性实验结果良好，是否符合重复性要求。 （4）准确度实验精密称取6份0.1g已知腺苷含量为1.485mg/g的蝉花子实体供试品粉末（对照品），置20mL塞具试管中，分别精密加入“3.1.1”项下对照品溶液300g，再分别精确加入超纯水10mL，摇匀按“2.2.1”项下方法，制备同等浓度供试样品溶液6份。分别精密取各供试品1mL，各精确加入超纯水1mL制成2倍稀释液，即得待测液，混匀备用。分别精密取上述待测液各20g，按“3.2”项下色谱条件分别进样，测定峰面积积分值，由回归方程得待测腺苷总浓度（g/ml）根据公式2计算回收率。若回收率在95%105% 范围内， RSD%5%，说明回收实验结果良好，符合标准度要求。2.7 腺苷样品的测定 分别精密取“3.1.1”项下腺苷供试样品待测液各20l，按“3.2”项下色谱条件分别进样测定峰面积积分值并记录。带入腺苷标准曲线回归方程计算腺苷含量。2.8 麦角甾醇含量的测定（1）麦角甾醇标准曲线的制定精确称取麦角甾醇标准品10mg，置于25mL容量瓶内，用三氯甲烷溶解并稀释至刻度。即得400g/ml麦角甾醇标准溶液。分别稀释得200g/ml、100g/ml、50g/ml、25g/ml标准溶液。按“3.2”项下色谱测定峰面积积分值。根据样品浓度和峰面积来制定标准曲线。以对照品溶液浓度（g/ml）为横坐标X，峰面积积分值（微伏秒）为纵坐标Y。（2）麦角甾醇样品的检测分别精密取“3.1.2”项下麦角甾醇供试样品待测液各20l，按照“3.2”项下色谱条件分别进样，测定峰面积积分值并记录，带入麦角甾醇标准曲线计算麦角甾醇含量。2.9 甘露醇含量的测定（1）甘露醇标准曲线的制定精密称取干燥至恒重的甘露醇标准品50mg，加蒸馏水50mL配制成1mg/ml的甘露醇溶液。然后分别稀释配制成质量浓度为10g/ml、20g/ml、30g/ml、40g/ml、50g/ml的甘露醇标准品溶液。以对照品溶液浓用分光光度计在412nm波长处，测定吸光度。以甘露醇含量（g/ml）为X轴，以吸光度（OD）为Y轴。（2）甘露醇样品的检测 精密量取供试样品溶液100L，加入10mL刻度试管中，加1mL高碘酸钠溶液，混匀，室温放置10min，加入2mL 0.1% L-鼠李糖溶液以除去过多的高碘酸钠，混合后加4mL新配制的Nash试剂于53水浴加热15min使其显色；之后迅速冷却至室温，用分光光度计在412nm处，测定吸光度。以蒸馏水代替样品溶液，用同样的方法操作作为对照，测定其吸光度，记录并带入甘露醇标准曲线计算甘露醇的含量2.10数据处理分析 采用SPSS软件对实验数据进行单因素方差分析，各组数据以平均值标准差表示；组间差异应用Duncan新复极差法进行检验。研究内容1. 蝉花孢梗束样品的准备2. 设置不同方式对蝉花孢梗束进行处理60烘干（CK）、80烘干、100烘干、沸水蒸汽蒸煮后60烘干。3. 水分含量的测定4. 腺苷标准曲线的制作 （1）标准曲线的制作和回归方程的计算； （2）标准曲线线性范围的确定；（3）回收率实验；5. 不同处理蝉花孢梗束样品中腺苷含量的测定6. 麦角甾醇检测结果（1）标准曲线的制定（2）麦角甾醇样品检测7. 甘露醇含量的检测（1）甘露醇标准曲线的制定（2）甘露醇样品的检测8. 各样品腺苷、麦角甾醇和甘露醇含量变化的比较及差异显著性分析主要参考文献1 滕晔，官宗华，宋玉良. 野生蝉花与人工培养品种氨基酸、无机元素成分的比较J. 浙江中医药大学学报，2012，10(2): 1123-1126.2 Fujita T, Inoue K, Yamamoto S, et al. Fungal metabolites. Part 11. A potent immunosuppressive activity found in Isaria sinclairii metabolite.J. Journal of Antibiotics, 1994, 47(2):35-36. 3 张红霞, 高新华, 陈伟,等. 人工培育蝉花与天然蝉花中化学成分的比较J. 食用菌学报, 2012, 19(3):59-62. 4 梁宗琦. 我国虫草属真菌研究开发的现状及思考J. 食用菌学报, 2001, 8(2):53-62. 5 许胜杰，叶淑幸，陈劲初. 新资源食品蝉花菌丝体的开发J. 食药用菌，2011，19(6): 34-38.6 Cheng J W, Wang Y B, He L, et al. Optimization of fermentation process for the production of intracellular polysaccharide from Paecilomyces cicadae and the immuno-stimulating activity of intracellular polysaccharideJ. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2012, 28(12):3293-3299.7 Ukai S，Matsuura S，Hara，C. Structure of a new galactomannan from the ascocarps of Cordyceps cicadae shingJ. Carbohydrate Research. 1982，101: 109-116.8 Takano F, Yahagi N, Yahagi R, et al. The liquid culture filtrates of Paecilomyces tenuipes (Peck) Samson (=Isaria japonica Yasuda) and Paecilomyces cicadae (Miquel) Samson (=Isaria sinclairii (Berk.) Llond) regulate Th1 and Th2 cytokine response in murine Peyers patch cells in vitro and ex vivo.J. International Immunopharmacology, 2005, 5(5):903916. 9 谭初兵，汤立达，徐为人. 2010年美国FDA批准新药简析J. 现代药物与临床，2011，26(2)81-83.10 林施施，杨欣. 黄锦海免疫调节剂Fingolimod 治疗多发性硬化症的机制和研究进展J. 医学综述2013，19(7): 1193-1195.1