溶藻细菌开题报告.docx

一、选题的依据及意义随着全球水体富营养化的加剧，有害藻类的暴发日趋频繁，给环境、生态和经济造成了巨大的损失。对水华藻类治理的方法中，物理除藻法简单易行，见效快，可用于应急处理水华，但是物理除藻法效率低，成本高，受地域限制，不能大规模使用，而且物理法治标不治本，只在短时间内有效，不能彻底根除水华。化学药品灭杀法虽然能有效杀死藻细胞，但是需要向水体中引入新的化学成分，一些杀藻剂甚至还具有毒性，会造成二次污染；而且有些杀藻剂对藻细胞有破坏作用，可使有毒藻类分解而释放出藻毒素，对其他水生动植物造成危害，甚至还会危害人类健康。因此有必要探索快速、高效、经济的新型治理方法。基于现代生态环保理念，越来越多的研究者将目光投向了水华的生物防治技术。生物方法治理水华因其具有操作简单、高效、不会带来环境的二次污染等诸多优点，被认为是最具有前途的水华防治方法之一。其中，细菌防治水华因具有独特双重优越，其既可去除水华藻细胞使得水体环境保持长期可靠的生态平衡，从而达到防治水华的目的，又可以避免藻类毒素可能富集的缺陷，被认为是一种绿色的可持续发展的理想的防治方法。溶藻细菌研究有望成为未来一段时期富有挑战的课题。但总体而言，目前对溶藻细菌的研究尚处于初级阶段，特别是我国溶藻细菌的研究更是处于起步阶段，现有报道也主要集中于对溶藻细菌的分离、鉴定及溶藻现象的描述，溶藻细菌对藻类的作用机理一直是溶藻研究中的瓶颈。导致国内外罕有溶藻细菌实践应用的报道。对溶藻物质性质的研究也较少，大部分溶藻细菌的溶藻活性物质尚未被纯化和鉴定，这也限制了溶藻活性物质的进一步开发和应用。 鄱阳湖位于长江中下游南岸，其流域面积的96.85%在江西境内，鄱阳湖汇纳流域内赣江、抚河、信江、饶河、修河五大河来水，经调蓄后，由湖口注入长江，其水系年均径流量约占长江流域年均径流量的16.3% “鄱阳湖在维护生物多样性，调蓄长江洪水以及长江中下游淡水供给等方面具有十分重要的作用，对维系区域和国家生态安全具有重要的战略意义”。近来，鄱阳湖水质受到严重的污染，水华现象经常发生。因此对于水华的治理刻不容缓。本实验，针对溶藻细菌的特性进行研究。二、国内外研究方向及发展趋势国外已报道的溶藻细菌主要有交替假单胞菌、黄杆菌属、弧菌属、嗜胞菌属、腐生螺旋体属、粘细菌属和鞘氨醇单胞菌属等。我国华中师范大学的彭超等分离获得3株溶藻细菌，生理生化鉴定为葡萄球菌属、芽孢杆菌属和节杆菌属。目前，国内外溶藻细菌一般分离自发生水华或赤潮的海洋及湖泊，大多为革兰氏阴性菌，而且对溶藻细菌所作研究侧重于溶藻现象和溶藻方式，对溶藻细菌菌体浓度与溶藻作用之间的关系尚未涉及，菌株的鉴定也只限于生理生化试验。由于溶藻细菌在自然水体中存在的比率比较低，故采用传统的方法分离比较困难，需要浓缩大量水样，耗时且很难获得理想溶藻细菌，与将来工程实际应用相距甚远。实际上，国内对溶藻细菌的研究仅处于起步阶段，在分子生物学水平上对溶藻细菌的研究尚未涉及。因此,寻找溶藻细菌分离源，实现短时间内分离筛选获得所需菌株，对溶藻细菌的深入研究及应用具有重要意义。三、研究内容及实验方案研究内容1、溶藻细菌的培养及分离2、溶藻细菌的溶藻方式实验方案1.材料与方法1.1 材料1.1.1 藻种及其培养选用的藻种为蓝藻中的铜绿微囊藻、水华鱼腥藻，均来源于中国科学院水生生物研究所藻种保藏中心。藻种经活化后，在 230.5，光照强度为 3000 lx，光暗周期比 14h：10h 条件下培养。1.1.2 培养基(1)肉膏蛋白陈液体培养基 ；(2)肉膏蛋白陈固体培养基：每100mL肉膏蛋白陈液体培养基加入琼脂1.52.0g；(3)蓝藻培养基BG11 ；(4)制备两种蓝藻固体培养基，其中琼脂培养基和软琼脂培养基的琼脂含量分别为1.5%和0.8%。1.2 方法1.2.1 溶藻细茵的分离(1)细茵的初筛：从鄱阳湖中采回水样中，划线挑取菌落形态不同的菌种纯化，分别编号为 L1L20，转移到斜面培养基培养2448h，用无菌水刷下制成菌液备用，同时用固体平板法计数；(2)利用液体感染筛选溶藻细菌：将扩大培养1周的水华鱼腥藻和铜绿微囊藻悬浊液， 用蒸馏水调配至在680nm处吸光度值为0.5， 取10mL移入20mL试管，再接种1mL菌液，混合均匀，同时设置空白对照。置光照培养箱培养812d，在 230.5，光照强度为 3000 lx，光暗周期比 14h：10h 条件下培养。 每隔24h 取样观察藻类的形态变化，如空白对照的蓝藻生长正常，而处理样黄化，取黄化藻液适度稀释，平板涂布，获得纯培养茵株，置蛋白胨培养基斜面保存；(3)利用固体感染分离溶藻细茵：以琼脂培养基作底层平板，将 0.1mL 菌液、5mL 供试蓝藻和 3mL 熔化并冷却至 47C的软琼脂培养基混合均匀迅速倾注到底层平板上， 琼脂固化后进行培养，在 230.5，光照强度为 3000 lx，光暗周期比 14h：10h 条件下培养。至溶藻空斑出现后，反复验证 23 次，平板涂布以获得纯菌株。 液固体感染共分离得到两株溶藻细菌，编号 L7 和 L18。1.2.2 细茵鉴定和细菌生长曲线的测定(1)生理生化鉴定：革兰氏染色:取菌液进行革兰氏染色,于光学显微镜下观察菌体染色结果。碳源利用:在 96 孔平板上,除对照孔不含碳源外,每孔都含有四氮唑紫缓冲的营养培养基和不同碳源,根据菌株革兰氏染色结果选择不同的测试板。将待测菌株在琼脂培养基上培养得到新鲜菌体,通过干管分散技术将菌悬液调节到适当浓度,用加样器将菌悬液加入到微孔板中,在有氧环境中培养 24h 后,用菌种鉴定仪检测显色反应,用 MicroLog4 菌种鉴定软件进行数据分析.(2)16srDNA序列分析方法：DNA提取、PCR 扩增及序列测定，将所测的序列在GenBank 数据库中进行 BLAsT 比对， 并提交到GenBank 中获得登录号。1.2.3 细菌生长曲线的测定细菌生长曲线用比浊法测定，将 0.1mL 的菌液接种于肉膏蛋白陈液体培养基 20mL 中，在 37下培养，每隔 12h 取样在 450nm 处测定吸光度值。1.2.4 溶藻方式的研究用正交试验 L 9 (3 4 )分析溶藻方式，考查不同生长时期、 不同滤液来源及不同投加滤液体积分数的效果，因素设置如表 1。 菌液 （ 浓度 1.0108cfu/mL）经过0.22m 玻璃纤维滤膜过滤两次，滤液加到藻液中，设置一个重复，培养条件同 1.1.1，每隔 24h 在 680nm 处测定吸光度值，共测 8d。图为 C 因素供试藻种只有两种纯藻， 故设置 C1和 C2 相同都为水华鱼腥藻。 同时设单因素投加滤液体积分数实验，考查 10%、20%、30%、40%、50%的滤液对溶藻效果的影响。1.2.5 菌液浓度对溶藻效果的影响试验(1)对铜绿微囊藻的溶解效果：将不同浓度的 L7、L18 及混合菌液 （ 两株菌等体积等浓度混合）分别加入到铜绿微囊藻中， 使菌液浓度分别为 0、1.0102、1.0104、1.0106cfu/mL，每隔 24h 在 230.5，光照强度为 3000 lx，光暗周期比 14h：10h 条件下培养。680nm 下测定吸光度值来考查溶藻效果 （ 因为是纯藻培养液，不含有自然界水体中其它含有叶绿素的生物，所以吸光度值的变化可很好的表征铜绿微囊藻的去除效果） (2)对水华鱼腥藻的溶解效果：方法同上，只是供试藻种换成水华鱼腥藻。四、目标、主要特色及工作进度通过本实验，溶藻细菌的培养及分离方法，可以为治理水华提供很好的实验基础，同时研究溶藻细菌的溶藻方式可以更加直观的、细致的认识到溶藻细菌的作用方式，从而更容易的研究溶藻的物质有哪些，从而减少在实际应用中没必要的人力、物力和财力。使实验室中的实验，能够更快的应用的真实的治理水华或赤潮。本研究中对溶藻细茵的分离筛选方法，避免了传统方法浓缩量大，耗时等弊端，对找出高效的分离筛选方法起到参考作用。参考文献l 刘晶,秦玉洁,匠嵌伦,等. 生物操纵理论与技术在富营养化湖泊治理中的应用J. 生态科学, 2005, 24(2):l88-l92.2 赵传鹏,浦跃朴,尹立红. 溶藻细茵及其测定评价方法的研究进展J. 东南大学学报(医学版), 2005, 24(3):202-206.3 张勇,席宇,吴刚. 溶藻细茵杀藻物质的研究进展J.微生物学通报, 2004, 3l(l):l27-l3l.4 Iamura N, Motoike I, Noda N, et al. A novel anticyanobacterial compound produced by analgae lysing bacteriumJ. J. Antibiotics, 2000, 53(ll):l3l7-l3l9.5 彭超,吴刚,席宇,等. 3 株溶藻细茵的分离鉴定及其溶藻效应J. 环境科学研究, 2003, l6(l):37-40.6 赵斌,何绍江. 微生物学实验M. 北京:科学出版杜, 2002.7 裴海燕,胡文容,曲音波. 一株溶藻细茵的分离鉴定及其溶藻特性J. 环境科学学报, 2005, 25(6):796-802.8 Imamura N, Motoike I, Shimada N, et al. An efficient screening approach for anti-Microcystis compounds based on knowledge of aguatic microbial ecosystemJ. J.Antibiotics,200l, 54(7):582-587.9 Fisher M M, Wilcox L, Graham W. Molecular characterization of epiphytic bacteria communities on charophycean green algaeJ. Appl. Environ. microbiol., l998,64(ll):4384-43