观察DNA和RNA在细胞中的分布-2.ppt

观察DNA和RNA在细胞中的分布 Brachet反应 光镜下常用的核酸染色方法 Brachet反应的染色原理 甲基绿（Methyl green)和 吡罗红(Pyronin, 又译派若宁、派洛宁，又称焦宁） 染色液（Unna试剂）的配制 方法步骤及结果的比较 可参考书目 必修一实验三 光镜下常用的核酸显色方法 显示DNA多用Feulgen反应:1N盐酸 60水解 810分钟(使DNA分子暴露出醛基)，水 洗去盐酸后,用Schiff 试剂染色 该反应优点：1。专一性强 2。可用于定性和定量分析 显示RNA多用Brachet反应 该反应优点：可同时显示DNA和RNA 缺点：专一性不强（1。甲基绿、派若宁均为 碱性染料，甲基绿单独使用时能使DNA和RNA均染成 蓝绿色，派洛宁单独使用时能使DNA和RNA均染成红 色。2。甲基绿同时可染其他物质如粘液) 染色原理 l 将甲基绿和派若宁配成混合染液（Unna试剂）时，甲基绿 多和DNA选择性结合显示蓝绿色，派洛宁多和RNA选择性结合 显示红色。其原因可能是当配成混合染液时，两种染料同时存在 而出现竞争作用：甲基绿与DNA亲和力大,易和聚合程度高的 DNA结合，而派洛宁与聚合程度较低的RNA结合。但空间构型 不完整的DNA也能与派洛宁结合显示红色。 l 故用该法所得的红色反应来显示RNA的存在并不具有专一 性。需做对照试验：利用专一性的RNA酶使嗜派洛宁染色性消减 ，这种反应具专一性，借助该反应才能说明被染上红色的确是 RNA，故做对照实验是必要的。 DNA 染料 一般认为甲基绿与DNA 亲和力高、派若宁与RNA亲 和力高的原因有两个： 1、DNA和RNA分子的聚 合程度不同，DNA比RNA聚合程度高。 2、甲基绿分子的两个N基团正电荷的距离正好与DNA分子的负电基 团间的距离相一致所以容易结合，而派若宁只有一个N基团正电荷 ，竞争不过DNA与甲基绿的结合见上图） 故一般认为甲基绿对DNA的结合能力主要与DNA分子的双 螺旋空间构型的完整性有关 甲基绿 甲基绿生产厂家不同，甚至批号 不同染色效果会有较大差别。商品甲 基绿常混有甲基紫，会影响染色效果 。 甲基绿溶于水，不溶于氯仿（三 氯甲烷）；甲基紫溶于氯仿。利用该 特性可用氯仿洗脱甲基紫：将甲基绿 水溶液放入分液漏斗，加入氯仿，用 力振摇，然后静置，待溶液分层后弃 氯仿。如此反复数次，直到氯仿不呈 紫色为止。 派若宁 有Pyronin Y、B等，Y是四甲基 化合物，B是四乙基化合物。 有学者认为Y适用于该反应，B 会使胞浆产生非特异性染色。 染色液（Unna试剂）的配制 甲液：5%Pyronin水溶液 （可加热助溶） 6ml 2%甲基绿水溶液 6ml 蒸馏水 16ml 乙液：1M醋酸盐缓冲液（pH=4.8） 16ml （配方：A液：冰醋酸6ml加蒸馏水至100ml B液：醋酸钠13.6克加蒸馏水至100ml 取A液40mlB液60ml混匀即为pH=4.8的缓冲液 一周内有效，用前现配） 甲乙两液分别置4冰箱备用，用时混匀。 （上述配法参考汪德耀主编细胞生物学实验指导 1981 高教版 其它配法可参考芮菊生等编著组织切片技术 1980 高教版） 配制注意事项：吡罗红（Pyronin）可加热助 溶。甲基绿(Methyl green)批号不同，染色效 果差别很大。商品甲基绿常混有甲基紫，影响染 色效果，应先把药品放在分液漏斗中，加入足量 的氯仿，用力振荡，然后静置，直到洗脱甲基紫 为止，最后干燥备用。 方法步骤及结果的比较 一.核心步骤： Unna试剂染色530染色前不做盐酸 处理也可观察到正确的染色结果. 二.辅助性步骤: (一).盐酸处理 此步骤需处理得当才有高中教材中所述作用效果。若 浓度过高、处理温度过高、时间过长，结果核不是呈蓝绿色， 而是与细胞质一样呈红色。 关于盐酸浓度：质量分数8%盐酸处理所得结果 体积分数8%盐酸处理所得结果 (二)有些资料介绍染色后用丙酮短时间(多为30）处 理有分色的效果 方法与步骤实例 (洋葱鳞茎内表皮) 实验片： 撕取小块洋葱鳞茎内 表皮，置载玻片上。 滴12滴95%酒精，处理10分钟 滴2滴Unna试剂，染色15分钟 吸去多余染液，滴加蒸溜水漂洗2次， 吸去多余水分。 盖上盖玻片，镜检。 实验片： 在洁净载玻片上滴一滴生理盐 水，漱口, 用消毒牙签刮取口腔上皮 细胞, 将附有材料的一端放在载片液 滴中涂抹几下 点燃酒精灯，烘干。 滴12滴95%酒精处理10分钟。 滴1滴Unna试剂，染色10分钟 吸去多余染液，用清水洗净。 盖上盖玻片，镜检。 方法与步骤实例 (人口腔上皮细胞) 实验方法改进 人口腔上皮细胞染色及观察 将课本上“步骤二 、水解”一步删除，以避免HCL带来的影响，这样 细胞核能被染成绿色。推测HCL除了影响吡罗红甲 基绿染色剂作用的pH值以外，还有可能作用于 DNA使之变性而不能与甲基绿染料分子结合导致实 验失败。 洋葱磷叶表皮细胞染色及观察 在洁净的载玻 片上滴加8的HCl一滴，将小块洋葱鳞叶表皮置于 液滴中浸泡5min，反复用1NaHCO3溶液清洗材 料3次，用吸水纸将载玻片上液滴吸干，滴加一滴 吡罗红甲基绿试剂染色5min后，盖上盖玻片，在显 微镜下观察。 课本录像中的实验效果 吡罗红甲基绿染色剂染色的口腔上皮细胞 （经质量分数为8的盐酸水解） 经质量分数为8%的盐酸水解、 吡罗红甲基绿染色剂染色的口 腔上皮细胞 经质量分数为8%的 盐酸水解、吡罗红 甲基绿染色剂染色 的洋葱鳞茎内表皮 细胞 按课本操作后实际实验效果 改良后的实验效果 吡罗红甲基绿染色剂染色 的洋葱鳞茎内表皮皮细胞 （未经8% 盐酸水解） 吡罗红甲基绿染色剂染色的 口腔上皮细胞 （未经8盐 酸水解） 可参考书目 l汪德耀主编细胞生物学实验指导 1981 高等教育 出版社 l芮菊生等编著组织切片技术 1980高等教育出版社 l徐根兴著定量细胞学和细胞化学技术1993