毕业论文——绿原酸纳米硒的制备及其抗氧化性的研究

JIANGXI AGRICULTURAL UNIVERSITY本 科 毕 业 论 文题 目： 绿原酸纳米硒的制备及其抗氧化性的研究 学 院： 食品科学与工程学院 姓 名： 学 号： 专 业： 食品质量与安全 班 级： 食安 指导教师： 职 称： 年 月目录摘要IAbstractII前言11材料与方法21.1 材料与试剂21.2 仪器与设备22 试验方法32.1 绿原酸纳米硒的制备32.2 绿原酸纳米硒的表征32.2.1 紫外分光光度法32.2.2 傅里叶红外光谱分析法32.2.3 荧光光谱法32.3 绿原酸纳米硒抗氧化能力测定42.3.1 还原力的测定42.3.2 清除羟自由基能力的测定42.3.3 清除超氧阴离子自由基能力的测定42.3.4 清除ABTS+自由基能力的测定53 结果与分析53.1 绿原酸纳米硒稳定性分析53.2 绿原酸纳米硒的表征53.2.1 CGASeNPs的紫外光谱分析53.2.2 红外光谱下的CGASeNPs63.2.3 绿原酸纳米硒荧光光谱分析73.3 绿原酸纳米硒抗氧化能力的测定73.3.1 绿原酸纳米硒还原力的测定73.3.2 绿原酸纳米硒清除羟自由基的能力83.3.3 绿原酸纳米硒清除超氧阴离子的能力93.3.4 绿原酸纳米硒清除ABTS+自由基的能力94 结论10参考文献11致谢12绿原酸纳米硒的制备及其抗氧化性的研究摘要绿原酸具有较好抗氧化，但其水溶性及稳定性较差。为了解决这一问题，本试验采用绿原酸直接还原制备绿原酸纳米硒（CGASeNPs）。选用荧光光谱法、紫外分光光谱法及傅里叶红外光谱法对所制得的CGASeNPs进行表征。并进一步通过对CGASeNPs对羟自由基、超氧阴离子、ABTS+清除能力及还原力测定，评估CGASeNPs抗氧化能力。结果显示，与CGA相比，CGASeNPs的紫外吸收峰，及傅里叶红外光谱当中的-OH特征峰均出现位移，说明已成功制备CGASeNPs。荧光光谱显示所制备的CGASeNPs具有荧光性。抗氧化试验显示CGASeNPs清除自由基及还原力均优于阳性对照组VC及CGA。本试验结果表明CGASeNPs是一种高效的、稳定且带有荧光特性的新型抗氧化材料，这为纳米材料做为抗氧化剂的应用提供一定的理论依据。关键词：绿原酸；纳米硒；制备；抗氧化AbstractChlorogenic acid has good oxidation resistance, but its water solubility and stability is poor. In order to solve this problem, chlorogenic acid nano selenium (CGASeNPs) was prepared by direct reduction of chlorogenic acid. The prepared CGASeNPs were characterized by fluorescence spectroscopy, ultraviolet spectrophotometry and Fourier transform infrared spectroscopy. The antioxidant capacity of CGASeNPs was further evaluated by the determination of hydroxyl radical, superoxide anion, ABTS+ scavenging ability and reducing power of CGASeNPs. The results showed that the UV absorption peaks of CGASeNPs and the -OH in Fourier transform infrared spectroscopy show that CGASeNPs have been successfully prepared compared with CGA. Fluorescence spectra showed that the prepared CGASeNPs were fluorescent. Antioxidant experiments showed that CGASeNPs scavenging free radicals and reducing power were better than those of positive control group Vc and CGA. The experimental results showed that CGASeNPs are antioxidant materials with efficient, stable and fluorescent properties, which provides a theoretical basis for the application of nanomaterials as antioxidants.Key words: chlorogenic acid; selenium nanoparticles; preparation; antioxidantII前言绿原酸（chlorogenic acid， CGA）分子式：C16H18O9，又称咖啡鞣酸，是由咖啡酸与奎尼酸形成的酯，具有较多的生物活性，如抗病毒、抗菌、降血压等 1。由于它含有一定量的R-OH基，能形成具有抗氧化作用的氢自由基，以消除羟基自由基和超氧阴离子等自由基的活性，从而保护组织免受氧化作用的损害2。然而，绿原酸本身不稳定，难溶于水，易溶于乙醇及丙酮等极性有机溶剂，且它的分子结构中有酯键、不饱和双键及多元酚3个不稳定结构，如下图所示。这也导致了绿原酸的生物利用度低、稳定性差。因此，绿原酸在人体中的使用受到很大程度的限制。纳米科学技术的到来，给人类认识自然和改造自然开辟了新的窗口。纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围(1-100nm)，或由它们作为基本单元构成的材料。纳米材料具有量子尺寸效应、表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应3，因此在光学、电学、热学、磁学等多方面表现出大块材料所不能比拟的优越性，在分析检测、生物传感、药物传递、生物医学等众多领域都有广泛的应用。因此，研究如何利用纳米材料实现对绿原酸的负载和传递，促进绿原酸发挥药效，具有十分重要的意义。硒是动物体必不可少的微量元素之一，化学符号是Se，一种非金属。硒有提高免疫力、预防癌症、抗氧化、拮抗有害重金属、调节维生素吸收与利用等作用4。但是硒的营养剂量和可耐受的最高摄入量之间的范围很窄，容易引起硒中毒5。纳米硒不仅有很高的生物利用率和生物活性，而且毒性很低，是目前被发现的毒性最低的硒形式5。本试验运用纳米技术将不稳定的利用价值高的绿原酸修饰在低毒、高生物活性的纳米硒上，既可以克服绿原酸不稳定的缺点，又能克服无机硒和有机硒毒性大这一缺点。随后用荧光光谱法、紫外分光光度法及傅里叶红外光谱法对CGASeNPs进行表征，试验结果说明我们获得了稳定的带有荧光特性的CGA修饰的纳米硒材料。由于绿原酸和硒均具有抗氧化的特点，我们对所制备的CGASeNPs的抗氧化性进行研究，确定我们所合成的CGASeNPs抗氧化能力与CGA对比有所提高，这说明绿原酸纳米硒有望成为一种高效的、稳定的新型抗氧化材料，为纳米材料做为抗氧化剂的应用提供一定的理论依据。1 材料与方法1.1 材料与试剂亚硒酸钠 山东西亚化学工业有限公司绿原酸（CGA，纯度为98%） 上海源叶生物科技有限公司2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS+） 上海源叶生物科技有限公司维生素C 上海蓝季科技发展有限公司 邻苯三酚 天津市大茂化学试剂厂盐酸 天津市大茂化学试剂厂磷酸二氢钠 天津市大茂化学试剂厂无水乙醇 天津市大茂化学试剂厂双氧水 天津市大茂化学试剂厂过硫酸钾 天津市大茂化学试剂厂绿矾 天津永大化学试剂开发中心水杨酸 天津永大化学试剂开发中心磷酸氢二钠 天津永大化学试剂开发中心Tris-HCl 北京索莱宝科技有限公司三氯乙酸 天津市福晨化学试剂厂铁氰化钾 天津市福晨化学试剂厂三氯化铁 西陇化工股份有限公司。1.2 仪器与设备超纯水机 厦门精艺兴业科技有限公司JD1000-2电子天平 沈阳龙腾电子有限公司GPX-9248干燥箱/培养箱（两用） 上海跃进医疗器械有限公司HH-数显恒温搅拌循环水箱 上海圣科仪器设备有限公司CL-3型恒温加热磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司UV-5200PC紫外可见分光光度计 上海美析仪器有限公司970CRT荧光分光光度计 上海棱光技术有限公司YP-2压片机 上海山岳科学仪器有限公司IS5傅里叶红外光谱仪 上海力晶科学仪器有限公司TGL-16GB台式离心机 上海书培实验设备有限公司TDL-5-A低速大容量离心机 上海安亭科学仪器厂SB-3200DTDN超声波清洗机 宁波新艺生物科技服份有限公司BDC-215KS电冰箱 青岛海尔股份有限公司2 试验方法2.1 绿原酸纳米硒的制备有研究表明，CGA溶解在50%的乙醇中并在4下保存最稳定7。因此，我们精密称取一定量的纯度为98%的CGA、亚硒酸钠，将绿原酸溶于50%的乙醇中，亚硒酸钠溶于超纯水中，将配制的25 mM绿原酸与0.1 M亚硒酸钠按一定的比例在450 r/min转速及室温下搅拌在一起直至溶液颜色由无色变为砖红色后停止搅拌，离心洗涤之后，重新溶解在50% 醇溶液中，4下过夜保存5-6。这种方法使得CGA修饰在纳米硒材料上，制得均一稳定的CGASeNPs溶液。2.2 绿原酸纳米硒的表征2.2.1 紫外分光光度法 制后的CGASeNPs在5000 r/min的转速下进行离心，弃上清液，所得的沉淀即为CGASeNPs，再用50% 乙醇溶解成样液。采用紫外可见分光光度法在200-600 nm的波长范围内对样液进行波谱扫描8，以50%乙醇做基准线校正液，将CGA醇溶液与CGASeNPs样液的紫外光谱图进行对比。2.2.2 傅里叶红外光谱分析法配制后的CGASeNPs在5000 r/min的转速下进行离心，弃上清液，所得的沉淀即为CGASeNPs。将所得沉淀的离心管用保鲜膜包裹后放入恒温干燥箱内进行干燥24h，用溴化钾压片后，用红外光谱仪对其进行红外分析。在400-4000 cm-1范围内分别对干燥后的CGASeNPs和CGA进行红外波谱扫描，记录其红外光谱9。2.2.3 荧光光谱法配制后的CGASeNPs在5000 r/min的转速下进行离心，弃上清液，所得的沉淀即为CGASeNPs。再用50%乙醇溶解所得沉淀制成样品溶液。以最大激发波长ex=350nm激发, 在380-600 nm之间检测最大发射波长em处的荧光强度值, 激发和发射的狭缝宽度均设定为10 nm10-11。2.3 绿原酸纳米硒抗氧化能力测定2.3.1 还原力的测定分别取20 g/mL、40 g/mL、60 g/mL、80 g/mL、100 g/mL的CGASeNPs溶液1 mL样品溶液于试管中，加入0.2 mol/L磷酸盐缓冲液1.25 mL (pH = 6.6)和1%的铁氰化钾溶液1.25 mL，混匀后于50 恒温水浴锅中水浴加热20 min后，快速冷却，再加入1.0 mL 10% 三氯乙酸，以3000 r/min的转速离心10 min，取上清液0.5 mL，加入0.1% 的三氯化铁溶液0.25 mL，再加1.75 mL蒸馏水，充分混匀后，在700 nm处测定其吸光值Ai，空白对照以1.0 mL蒸馏水代替样液测吸光度A013。以Vc及CGA为阳性对照，进行CGA、CGASeNPs与Vc的还原力大小对比。2.3.2 清除羟自由基能力的测定分别取20 g/mL、40 g/mL、60 g/mL、80 g/mL、100 g/mL的CGASeNPs溶液1.0 mL样品溶液于试管中，依次加入1.0 mL 6 mmol/L硫酸亚铁、1.0 mL 6 mmol/L双氧水，混匀后静置10 min，再加入1.0 mL 6 mmol/L水杨酸，混匀后静置30 min，于510 nm处测吸光度Ai。以1.0 mL蒸馏水代替水杨酸测吸光度Aj，空白对照以1.0 mL蒸馏水代替样液测吸光度A011-13。以Vc及CGA为阳性对照，计算羟自由基的清除率E：E =（A0-Ai+Aj）/ A02.3.3 清除超氧阴离子自由基能力的测定此试验是利用邻苯三酚的自氧化反应测定CGA对其产生的超氧阴离子的清除作用，在碱性的条件下，邻苯三酚发生自氧化反应，生成有色物质，我们通过加入样品溶液阻止中间产物的积累，吸光度降低，以Vc作为阳性对照，研究所制得的CGASeNPs的清除超氧阴离子能力是否提高。取pH = 8.2，2.25mL，50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液于试管中，加入1.0 mL蒸馏水，于25水浴加热20 min，再分别取20 g/mL、40 g/mL、60 g/mL、80 g/mL、100 g/mL的CGASeNPs溶液1 mL于试管中，再加入25 mmol/L的邻苯三酚0.25 mL混匀，在25水浴中反应6 min，立即滴加0.5 mL 10 mmol/L的盐酸终止反应，在320 nm下测定吸光值Ai，以1.0 mL蒸馏水代替邻苯三酚测吸光度Aj ，以1.0 mL蒸馏水代替CGASeNPs溶液测吸光度A011-14。以Vc及CGA为阳性对照，计算超氧阴离子自由基的清除率E。E =（A0-Ai+Aj）/ A02.3.4 清除ABTS+自由基能力的测定精密称取4.00 mg ABTS+粉末，然后加入新鲜配制的1.0 mg/mL的过硫酸钾溶液0.8 mL，密封后避光静置反应16 h，定量转移到25 mL的容量瓶中，再加入3.2 mL蒸馏水，用无水乙醇定容，放置10 h后使用。分别取20 g/mL、40 g/mL、60 g/mL、80 g/mL、100 g/mL的0.25mL CGASeNPs溶液于试管中，用80乙醇补至1.0 mL，再加入1.0 mL ABTS+工作液，摇匀，避光反应6 min，在734 nm下测吸光值Ai,以80乙醇代替样品溶液作为空白对照，测吸光度A015。以Vc及CGA为阳性对照，计算样品溶液对ABTS+自由基清除率E。E = （A0-Ai）/ A03 结果与分析3.1 绿原酸纳米硒稳定性分析图1 绿原酸纳米硒稳定性分析图制备后的CGASeNPs 4保存1到14天如图1所示，图中左边均为CGA醇溶液，右边是离心洗涤之后，重新分散在醇溶液中CGASeNPs溶液，我们可以看出CGASeNPs为均一稳定的砖红色溶胶状，通过两周的4冷藏保存，CGASeNPs溶胶状态几乎没有变化，说明CGASeNPs的稳定性良好。3.2 绿原酸纳米硒的表征3.2.1 CGASeNPs的紫外光谱分析从CGA与CGASeNPs紫外光谱如图2所示，CGA属于酚类物质，含有苯环、双键、羰基等不饱和结构，其329 nm 有紫外吸收峰8。制备出的CGASeNPs的吸收峰有些微的偏移，CGASeNPs的最高峰由CGA醇溶液337 nm移至334 nm处，蓝移了3nm。CGA修饰在纳米硒上使得吸收峰的位置发生一定的偏移，说明所制得的纳米硒表面修饰剂为绿原酸。图2 CGA与CGASeNPs紫外光谱图3.2.2 红外光谱下的CGASeNPsCGA具有酚羟基、苯环、羰基的特征吸收峰。从CGAs与CGASeNPs红外光谱如图3所示，CGA的羟基的峰在3353.99 cm-1处，制成的CGASeNPs的羟基的峰移至3419.00 cm-1处，合成后羟基的峰发生了红移，说明羟基参与了合成，CGA修饰到了纳米硒表面。图3 CGA与CGASeNPs红外光谱图3.2.3 绿原酸纳米硒荧光光谱分析从CGA与CGASeNPs的荧光光谱如图4所示，CGASeNPs的激发峰由CGA醇溶液的442.9 nm移至437.5 nm处，蓝移了5.4 nm。证明CGA被修饰到了纳米硒表面，制得了带有荧光特性的纳米硒材料。图4 CGA与CGASeNPs的荧光光谱图3.3 绿原酸纳米硒抗氧化能力的测定3.3.1 绿原酸纳米硒还原力的测定根据CGASeNPs、CGA与Vc的还原力如图5所示，还原力测试CGASeNPs、CGA和Vc的吸光值都随着浓度的增加而增大，说明在0 g/mL-100 g/mL，随着样品溶液浓度增加，其还原能力不断增强，并有良好的线性关系，在100 g/mL处的还原力CGASeNPs为1.304，Vc为0.704，CGA为0.468。CGASeNPs的还原力最强，其次是Vc，最后是CGA。说明将绿原酸修饰在纳米硒上之后，其还原能力得到了提高。图5 CGASeNPs、CGA和Vc还原力图3.3.2 绿原酸纳米硒清除羟自由基的能力CGASeNPs、CGA与Vc清除羟自由基能力如图6所示，在0 g/mL-100 g/mL，随着样品溶液浓度增加，CGASeNPs清除羟自由基的能力不断增强，在100 g/mL处羟自由基的清除率CGASeNPs为71.0%，CGA为67.0%，Vc为65.9%。CGASeNPs的还原力最强，其次是CGA，最后是Vc。说明制备的CGASeNPs的羟自由基的清除能力得到了提高。图6 CGASeNPs、CGA和Vc清除羟自由基能力图3.3.3 绿原酸纳米硒清除超氧阴离子的能力CGASeNPs、CGA与Vc清除超氧阴离子能力如图7所示，CGASeNPs清除超氧阴离子的能力最强，其次是Vc，最后是CGA。但是CGASeNPs在40 g/mL后的趋势逐渐平缓，Vc在60 g/mL后趋于平缓，并在80-100 g/mL时几乎相等，在100 g/mL处超氧阴离子自由基的清除率CGASeNPs为98.5%，Vc为98.0%，CGA为79.9%。说明通过将CGA修饰在纳米硒表面的手段提高了CGA清除超氧阴离子的能力，但是到达一定的浓度后其清除率不会再增加了。图7 CGASeNPs、CGA和Vc清除超氧阴离子能力图3.3.4 绿原酸纳米硒清除ABTS+自由基的能力CGASeNPs、CGA与Vc清除ABTS+能力如图8所示，表明所有样品对ABTS+自由基的清除能力都随浓度的增加而增强，其中CGASeNPs清除ABTS+自由基能力最强，其次是Vc，最后是CGA，但是绿原酸纳米硒在60 g/mL后的趋势逐渐平缓，Vc在80 g/mL后趋于平缓，在100 g/mL处ABTS+自由基的清除率CGASeNPs为96.0%，CGA为66.6%，Vc为96.0%。说明将CGA修饰在纳米硒上之后，其清除ABTS+自由基能力得到了提高,虽然能力逐渐增加，但是到达一定浓度后趋势逐渐平缓。图8 CGASeNPs、CGA和Vc清除ABTS+自由基能力图4 结论通过制备出的CGASeNPs样品溶液颜色的变化观察以及运用紫外分光光度法、傅里叶红外光谱法与荧光光谱法对CGASeNPs进行表征，各个特征峰的偏移说明我们成功的制备出了CGASeNPs。CGA修饰在纳米硒的表面，使得所制备的CGASeNPs在水中具有良好的稳定的分散体系。抗氧化性的试验表明CGA修饰后的纳米硒对于清除羟自由基、超氧阴离子、ABTS+的能力以及还原力都有显著的提高，CGASeNPs具有良好的抗氧化效果。这种方法的操作过程简便、所选用的试剂无毒、反应条件温和，所制备的 CGA修饰纳米硒作为新型抗氧化剂具有良好的应用前景。11参考文献1 徐贤柱，魏允，饶华，等. 绿原酸纳米脂质体制备与抑菌性分析J. 食品科学，2014，34(20)：62-66.2 李健民，徐艳明，朱魁元，等. 杜仲抗氧化生物活性研究进展J. 中医药学报，2010，38(02)：137-139.3 丁静. 碳纳米管和纳米金颗粒用于DNA和小分子检测的研究D. 湖南大学，2011. 4 Brooks J D， Metter E J， Chan D W， et al. 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