（黄顺葵）11dna重组技术的基本工具课件课件

专题一：,20150317,生物1的基因（目的基因）,生物2,获得新性状,导入,第一至三步骤 三个工具,第四步骤,限制酶 DNA连接酶 运载体,一、限制性核酸内切酶“分子手术刀”,1. 种类与命名,现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内切酶(限制酶)。,粘质沙雷氏杆菌 （Serratia marcesens）,Sma,大肠杆菌 （Escherichia coli R）,EcoR,练习：流感嗜血杆菌的d菌株( Haemophilus influenzae d )中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:,Hind、Hind和Hind,命名方法,2.作用特点断开磷酸二酯键,EcoR,黏性末端,黏性末端,2.作用特点断开磷酸二酯键,Sma,平末端 平末端,A,A,T,T,G,C,C,T,T,A,A,G,限制性内切酶与DNA解旋酶的区别,切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键,将DNA两条链的氢键打开形成两条单链,限制性内切酶与DNA水解酶的区别,切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键，形成片段的DNA.,切割磷酸二酯键，形成单个的脱氧核苷酸。,你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？,原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物 在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机 制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细 菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会 利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的 安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切 割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的 目的。,寻根问底,为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？,通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。,二、DNA连接酶 ”分子缝合针 ”,3,作用原理：催化磷酸二酯键形成,1.连接酶类型,EcoliDNA连接酶,T4DNA连接酶,来源,功能,大肠杆菌,T4噬菌体,恢复 磷酸 二酯键,只能连接黏性末端,能连接黏性末端和平末端(效率较低),相同点,差别,两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来,DNA连接酶的缝合作用,可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，,注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口，但不能连接单链DNA！,DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？,T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低,DNA连接酶的缝合作用,都能催化形成磷酸二酯键,都是蛋白质,不需要,需要,形成完整的重组DNA分子,形成DNA的一条链,基因工程,DNA复制,DNA连接酶与DNA聚合酶的比较,只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键,在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,A A T T G,C,DNA聚合酶的作用,限制性内切酶的识别序列和切点是GGATCC，限制性内切酶的识别序列和切点是GATC。在质粒上有酶的一个切点，在目的基因的两侧各有一个酶的切点。 （1）请画出质粒被限制酶切割后所形成的黏性末端。 （2）请画出目的基因两侧被限制酶切割后所形成的黏性末端。 （3）在DNA连接酶作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接？为什么？,可以连接。因为由两种不同限制酶切割后形成的黏性末端是相同的（或是可以互补的）,小试身手,4、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？,迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。,思考与探究 P7,基因工程基本操作的四个步骤,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,限制酶,限制酶 DNA连接酶,三、载体 “分子运输车”,无切割位点,一个切割位点,二个切割位点,EcoR 切割的目的基因,EcoR,EcoR,EcoR,载体的条件 有1多个限制酶切点,目的是形成重组DNA分子,1.载体需要的条件：,用切目的基因相同的限制性内切酶切割质粒,EcoR切割质粒,一个切割位点,目的基因,1个切割位点,载体的条件 有1多个限制酶切点,载体的条件对受体细胞无害 能在受体细胞中复制和表达,载体的条件具有标记基因,有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。,有切割位点,能复制并带着插入的目的基因一起复制,裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。,2.最常用运载体质粒,思一思,2、能否用SARS病毒作为基因载体？,3、作为载体，若没有切割位点将怎样？,4、携带目的基因的