课件：发酵工程中的菌种.ppt

第四章 微生物优良菌种的选育,2019,-,1,微生物发酵的一般流程,2019,-,2,提纲,微生物优良生产菌种的特征 自然突变选育 诱变选育 原理 基本方法 杂交育种 细菌 放线菌 霉菌 酵母菌 原生质体融合 基因工程技术 基因表达系统 利用大肠杆菌的基因表达系统 利用酵母菌的基因表达系统 基因工程菌的稳定性,2019,-,3,优良菌种应具备的特征,对菌种的要求 天然菌种的生产性能较低，一般需要进行选育。 1.生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代谢产 物的产量高，其它代谢产物少 2.操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离 3.稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯，不易变异退化 4.安全性：是非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素,2019,-,4,优良菌种应具备的特征,选择生产菌种应注意的因素 1.原料方面：广，转化率高； 2.产物方面：目的产物含量高，副产物少； 3.菌体方面：生长快、繁殖力强，耐受力强，抗污染、抗噬菌体能力强，遗传特性稳定 4. 设备方面：产泡沫少，适宜大罐生产。 （培养条件异，周期短，需氧量小，抗污染能力强）,2019,-,5,一、自然选育,利用微生物自然突变进行的菌种选育。 原因：多因素低剂量的诱变效应； 互变异构效应 结果：负变大于正变，应经常分离纯化 方法：菌悬液平板分离上摇瓶检测 选种保藏 优点：简单易行，可与生产同步进行。 缺点：频率低，10-810-9 /次分裂。,2019,-,6,二、诱变选育,诱导微生物发生突变进行的菌种选育，包括诱变和筛选两个步骤。 原理：染色体畸变；基因突变。 影响诱变的因素： 出发菌株（有一定生产能力，形态、生理强壮） ； 诱变剂的种类（单一或复合）与剂量（不宜过高和过 低，致死率：70-80）。 诱变剂：能提高基因突变频率的物理、化学、生物因子。 筛选比诱变更重要。 筛选的方法：通过选择/鉴别培养基加以识别。 初筛复筛确定最佳发酵条件（负变多，正变少）,2019,-,7,、营养缺陷型突变株筛选,酶缺陷，结果造成中间产物积累； 解除协同反馈，使另一分支末端产物积累； 渗漏型突变（酶未完全丧失活性，下降），末端产物少，中间产物积累。,2019,-,8,、抗反馈阻遏和抗反馈抑制 突变株筛选,调节基因或操纵基因突变，产生的阻遏蛋白与终产物不能结合或结合； 结合，但不发生作用； 结构基因突变，使结构酶无结合能力但有催化活性； 方法：末端产物结构类似物筛选；（未突变者 死，突变为抗者，生并产菌落） 营养缺陷型回复突变株筛选。 （活性复，结构改变）,2019,-,9,、组成型突变株筛选,诱导型依赖诱导物。组成型不依赖诱导物。 突变发生在调节基因或操纵基因,解除对诱导物的依赖,可获组成型突变株。 筛选方法：设计条件使组成型优势生长，或通过菌落分辨。 加诱导酶合成抑制物 交替培养法 显色反应法,2019,-,10,筛选方法,加诱导酶合成抑制物 如：加邻硝基-D-岩藻糖苷，抑制-半乳糖苷酶合成。 诱导型不能利用乳糖，不长；组成型产酶，能利用乳糖，生长，被富集。 交替培养法 含诱导物（乳糖）中培养组成型快不含诱导 物（葡萄糖）中培养诱导型失酶反复。 显色反应法 不含诱导物平板培养加底物分解（有颜色变 化）检出。,2019,-,11,.抗（敏感）性突变株筛选,包括：抗生素、金属离子、温度、噬菌体 抗生素抗性突变：提高产量； 抗噬菌体突变：消除噬菌体污染； （与噬菌体存在与否无关） 条件抗性突变：如温度，可提高产量； （温度敏感突变，高温呈营养缺陷表型） 物敏突变： 如：氟乙酸抑制顺乌头酸酶，氟乙酸敏感突变型， 顺乌头酸酶活性极低，更敏感，异柠檬酸产量 少，柠檬酸积累。,2019,-,12,三、杂交育种,长期诱变会使菌种生活能力下降。 借助有性重组，使不同菌株的遗传物质 得以交换（获优良性状集中的重组体）。 1.细菌的杂交育种 方法：转化、转导、F因子转导、R因子转移、接 合。获部分合子。 出发菌株需带遗传标记：营养缺陷、抗生素抗性、 温敏、发酵性能,2019,-,13,、放线菌的杂交育种,基因重组过程近似细菌，育种方法与霉菌相似 放线菌的遗传体系和杂交原理： 异核现象：同一细胞（菌丝）含不同基因型的核。无 重组体出现。 接合现象：发生部分染色体转移（交换），形成部分 合子。整+部分、部分+部分。 异核系的形成：部分合子产生的无性繁殖系。能在基 本或选择培养基上生长。 （单交换，二体区） 重组体的形成：异核系不稳定，可经过双交换形成重 组子，产生重组子孢子。,2019,-,14,放线菌的杂交方法,混合培养法：两互补缺陷型亲株混合培养，制孢 子悬液，选择性平板分离。 平板杂交法：一亲株培养，形成孢子，影印至已 分别铺有另几种孢子的平板上，获 孢子后再影印至选择平板上。 玻璃纸转移法：两亲本需要双标记，混合带纸培 养，未长气生菌丝时，纸移至一选 择平板，获异核系。解剖镜下，小 针收集小菌丝，于完全平板涂布， 获分离子。,2019,-,15,、霉菌的杂交育种,准性生殖过程：不通过有性生殖的基因重组过程 异核体的形成：两不同性状细胞（菌丝）连接，导致一 细胞存在两个不同遗传型核。 杂合二倍体形成；异核体偶尔发生不同核的融合，形成 杂合核，为双倍体。 菌丝成斑点、扇面扇变。 体细胞重组：杂合二倍体只具有相对稳定性，繁殖过程 发生染色体交换，单倍化，形成各种分 离子。 准性生殖的单倍体化是一个渐变过程，需要多次分 裂，形成双倍体、非整倍体、单倍体等分离子。,2019,-,16,霉菌的杂交技术,诱变获具标记的亲本。 异核体的形成：基本培养基上，强迫进行 营养互补。还可用多种方法。 双倍体检出：可从扇面上挑孢子分离。 分离子检出：杂合二倍体单孢子平板分 离，检菌落斑点或扇面，斑点处挑孢 子至斜面，再纯化鉴别。,2019,-,17,、酵母菌的杂交育种,双单特性：存在单倍体和二倍体的生活史 二倍体生活力强，生产能力高，可 通过杂交得二倍体来育种。 方法：获单倍体细胞；杂交。 杂交方式：孢子与孢子；孢子与单倍体细胞； 单倍体细胞间。,2019,-,18,四、原生质体融合育种,借助原生质融合技术实现遗传物质的交换 .原生质体融合的优越性： 受限制小； 重组频率高； 遗传物质传递更充分； 可先用理化因子处理； 其诱变率更高。 .原生质体融合法： 原生质体制备 原生质体融合和再生 融合子的检出 .原生质体融合技术在微生物育种中的应用： 选育高产优质菌株 产生新的产物,2019,-,19,五、基因工程育种,定向育种，技术含量高，应用面广。 应用：解决了一些药物或材料来源困难，或制造技术复杂，或造价昂贵而无法大量生产和应用的问题。 产生了巨大的经济和社会效益。 工业生产的意义： 基因的表达产量； 表达产物的稳定性； 产物的生物活性； 产物分离纯化。 （一）基因表达系统 从育种的角度考虑,最重要的是目的基因的高效表达。 .原核表达系统；.真核表达系统,2019,-,20,、原核表达系统,原核生物不适宜表达需后加工处理的那一部分真核基因 不能切除mRNA的内含子； 不能进行蛋白质的糖基化； 不能对氨基酸进行修饰。 大肠杆菌：遗传背景清楚；基因操作简便； 易培养，世代短，生长快；适宜大规模生产 注意：真核蛋白后修饰； 多为胞内产物；产物分离纯 化困难；内毒素；蛋白酶破坏产物；免疫反应。 枯草芽孢杆菌：分泌能力强；胞外蛋白酶强 链霉菌：使用安全；分泌能力强；具有糖基化能力,2019,-,21,、真核表达系统,产生的蛋白质与天然蛋白质具有一致的生理生化功能 酵母：真核生物蛋白质的最佳表达系统 优点：基因组小，操作方便； 世代周期短，易培养； 有单、双倍体形式；能糖基化；能分泌产物到胞外。 应用：干扰素、乙肝表面抗原基因已经成功表达； 酿酒酵母研究、应用最广泛。 丝状真菌： 特点：能进行翻译后加工； 表达产物分泌能力强； 安全； 发酵、纯化工艺成熟。,2019,-,22,（二）利用大肠杆菌的基因表达系统,.表达载体 条件： 能独立复制； 有灵活的多克隆位点和方便的筛选标记，位点位 于 起动子后； 有很强的起动子，能被大肠杆菌的RNA聚合酶识别； 有使起动子受抑制的阻遏子，受诱导时才转录，可人 为的通过理化因素选择启动时机； 有很强的终止子，使RNA聚合酶集中力量转录克隆 的外源基因；克服质粒高转录引起的质粒不稳定。 产生的mRNA须有翻译的起始信号，即起始密码 AUG和SD序列。,2019,-,23,、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素,目的基因的表达产量与每个细胞平均表达量 和细胞浓度正相关。 影响因素： 外源基因的拷贝数； 外源基因的表达频率： 启动子的强度； AUG和SD序列的间距； 密码子的组成； 核糖体结合位点的有效性 表达产物的稳定性； 细胞的代谢负荷。,2019,-,24,、在大肠杆菌中真核基因的表达形式,融合蛋白：N端原核序列，C端真核序列 表达高效、稳定，但影响免疫原性，可酶切。 非融合蛋白：保持生物活性，但易被水解 N端常带甲硫氨酸，引起人体免疫反应。 分泌表达蛋白：使外源基因位于原核蛋白 信号肽下游（连接、构建）。 在周质空间酶切，释放产物。,2019,-,25,（三）利用酵母菌的基因表达系统,.载体系统：多用穿梭载体，同时带有细菌和酵母复制原点和选择标记，在两者中复制、选择。 克隆载体的复制序列 酵母附加质粒(YEP) 酵母复制型质粒(YRP) 酵母着丝粒质粒(YCP) 酵母整合型质粒(YIP),2019,-,26,.载体系统,表达载体 在克隆载体中插入酵母表达盒和终止子等调控序列,即 可构建酵母表达载体。 需糖基化才有生物功能的重组蛋白必须是分泌型蛋白. 要在外源DNA上游加前导肽序列。 用啤酒酵母表达分泌型外源蛋白时，要求前导肽C端是赖精，其内切酶可识，切。 如：水蛭素（强抗凝剂，溶栓药物）用al因子前导肽（编码酵母交配类型因子的前导肽）基因附加型质粒载体，在酵母细胞中成功表达。,2019,-,27,、影响外源基因在酵母中表达的因素,外源基因的拷贝数：拷贝数，稳定性，整合位置； 外源基因的表达频率： 启动子：有上游激活序列、TATA序列、起始密码子； 分泌信号：包括信号肽、前导肽序列； 终止序列：合成基因须加或利用载体上的； 外源蛋白的糖基化：分泌过程中发生N-糖苷键和O-糖苷键连接的两种糖基化，其产物与天然产物完全相同 宿主菌株的影响：生长力强、内源蛋白酶弱、性能稳定、分泌力强，用二、多倍体。,2019,-,28,（四）基因工程菌的稳定性,分裂不稳定：分裂时，出现一定比例不含质粒的子代菌； 结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失、碱基重排或缺失。 1.产生原因：（常见是分裂不稳定） 产不含质粒的子代菌的频率； 两种菌的比生长速率。 质粒拷贝数低时，可增加，但不宜太高（生长负势 ）。 条件有利，高比生长速率，拷贝数降低，但更稳定。 质粒拷贝数过高，增加转录、翻译负担，产物未必增加。 2.提高质粒稳定性的方法： 两段培养法（先长菌，后表达）； 控制培养条件（温度、PH、培养基组分、溶解氧）。,2019,-,29,本章知识结构,1、微生物优良生产菌种的特征 2、自然突变选育 3、 诱变选育 4、 杂交育种 5、原生质体融合