泽蛙的性腺分化及温度对性别决定的影响.ppt

泽蛙的性腺分化及温度对性别决定的影响,动物学报 Acta Zoologica Sinica,主讲人：,主要内容,1 材料与方法 2 结 果与分析,动物的性别决定和性分化一直是生物学领域颇受关注的课题之一。目前已经知道,脊椎动物的性别决定机制主要有遗传性决定(Genetic sex determination, GSD)和环境性决定(Environmental sex determination,ESD)两大类。,有关温度对两栖类性腺分化影响的研究,早在20世纪初就有过报道。 用高温322培育美洲林蛙(Rana sylvatica)的蝌蚪,发现有雄性化的趋势。以后在北非肋突螈(Pleurodeles poireti)、冠欧螈和滞育小鲵(Hynobius retardatus)等一些(Triturus cristatus)两栖类,都有相类似的报道。 在我国,有关两栖类的性腺分化以及温度对性腺分化影响的研究极少,仅中国林蛙(Rana temporariachensinensis)有这方面的报道(李新红等, 2001)。,泽蛙(Rana limnocharis)体型小、分布广,是我国南方常见的种类。其生殖期较长,每年的4 -9月都可以从野外获得性腺发育成熟的雌、雄蛙进行人工催产,获得受精卵,因此是进行发育生物学实验的好材料。本文采用不同温度培育泽蛙的性别尚未分化的蝌蚪,观察在不同温度条件下,蝌蚪的发育状况、性分化规律以及雌、雄性比变化,探讨温度对泽蛙性腺分化的影响。,1 材料与方法,1.1 实验材料的获得 泽蛙捕获自福州市郊城门镇农田。2006 -2007两年在泽蛙的繁殖季节(4 -9月),挑选性腺发育成熟的雌蛙共150只,每批次人工催产雌蛙20 -30只,获产率90.5%。,1.2 不同水温的培育方法,将同一批次刚孵出蝌蚪(Gosner 25期)随机分成5组,每组150尾,其中4组为实验组,分别设定为181、301、32 1 、34 1温度处理组;在自然水温23 -25中发育的则为对照组。,1.3 取材及组织学制片,按上述方法另外培育一批每批次的蝌蚪,用以定期取样,制作组织学切片,观察原始生殖细胞的迁移、生殖嵴的形成以及性腺分化。采用Bouin液固定组织,常规梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋;制作连续横切片,切片厚7um, HE染色。切片标本置显微镜(配冷光源数码相机)下观察、拍照。对完成变态的幼蛙,进行解剖区分精巢或卵巢结构。,1.4 数据分析,对于测量数据以平均值标准差(Mean SD)表示。以Spss 13.0统计学软件对实验数据进行V2测验(V2-Test),主要比较各实验组幼蛙的成活率和雄性率与对照组的差异显著性(P0.05为差异显著)。,2 结 果与分析,2.1 性腺发生及分化 泽蛙的性腺分化以对照组2325 的为准。从孵化期蝌蚪开始至完成变态的幼蛙为止,体内原生殖细胞(Primordial germ cells, PGCs)的迁移、生殖嵴和原始性腺形成,以及性腺分化过程如下述,2.1.1 原生殖细胞的迁移和原始性腺的形成,刚孵出的蝌蚪, 观察蝌蚪躯干部过前肾和消化道的连续横切片,背大动脉之下腹膜上皮与消化道之间的背肠系膜上,可发现PGCs单个分布(图I: 1),数量很少。PGCs呈圆形或椭圆形,胞体明显较其周围的体细胞大,胞径均值(长径x短径,下同)为10.8umx8.8um,核径均值为6.8umx5.2um。核大,着色浅,核膜清晰可见,核仁1 -2个。,孵化后1 d蝌蚪,全长6.5 mm0.3 mm。切片观察, PGCs已迁移到背肠系膜两侧的腹膜上皮上,仍旧单个分布,胞径均值为11.4umx8.2um,核径均值5.9umx4.6um 。,4d蝌蚪,全长7.7mm0.6mm。在中肾管下方,靠近背大动脉的腹膜上皮上,左右两侧各向腹腔突出形成1对纵行隆起,此为生殖嵴(Germinal ridge)。刚出现的生殖嵴很小,由体细胞和PGCs构成。在生殖嵴中可以观察到1 -2个PGCs (图I: 5)。PGCs的胞径均值16.1umx12.2um,核径均值13.5umx10.5um。,6 d蝌蚪,全长912 mm0.5mm。生殖嵴体积略有增大,生殖嵴中的PGCs的数量增加,在一个切面上最多可见到5个PGCs (图I: 6)。PGCs体积有所变小,胞径均值为14.6umx11.0um,核径均值10.6umx6.4um。从6 d蝌蚪至12 d蝌蚪,生殖嵴变化不大。,17 d蝌蚪,全长17.2 mm0.8mm。生殖嵴中的PGCs和体细胞数量继续增多,体积增大。在生殖嵴中央出现了一个小腔隙,为初生性腔(Primary cavity)。PGCs和体细胞位于腔隙的周围。此时的生殖嵴可改称为原始性腺(Primordial gonad)。原始性腺横切面呈梨形。背方狭窄,通过背系膜悬挂于中肾管下的腹膜上皮两侧(图I: 7)。观察期所有的蝌蚪切片标本,在原始性腺中都有大小不等的初生性腔。此时,还不能在形态上区分哪些原始性腺将分化成卵巢,哪些原始性腺将分化成精巢。,2.1.2 卵巢的分化,22 d蝌蚪,全长20.3 mm0.7mm。原始性腺体积明显增大,呈长囊状。原始性腺中的初生性腔扩大,并且在腔的表面有一层单层扁平上皮,形成次生性腔(Secondary cavity)。PGCs位于腔的周围,并突向表面,在PGCs的周围分布着体细胞。PGCs形态变化不大,有的正处于有丝分裂期(图I: 8)。,34 d蝌蚪,全长30mm1.5mm。大多数蝌蚪的后肢五趾形成。在原始性腺中,次生性腔周围的PGCs大部分已分化成卵原细胞(图II: 9)。卵原细胞呈圆形或椭圆形,体积较大,细胞核大,核内的染色丝明显。胞径均值为39.4umx34.2um,核径均值33.9umx27.2um。此时的原始性腺可以改称为卵巢,其中的次生性腔称为卵巢腔。,2.1.3 精巢分化,30 d蝌蚪的原始性腺切片中观察到一种体积较小的原始性腺,呈椭圆形。初生性腔扩大,腔的表面没有单层扁平上皮,腔中出现了一些体细胞和血细胞。PGCs分布在腔的周围,胞径均值为14.1umx10.3um,核径均值为9.9umx7.6um (图II: 11)。,在34 -36d 的蝌蚪中,该类型原始性腺的初生性腔中,体细胞数增多,腔隙变小。腔外的PGCs也随着腔隙的缩小而向中央渗入,最终初生性腔消失。PGCs分化为精原细胞。部分精原细胞正处于分裂增殖期,并组成精小囊(Spermatogenic cyst),此时的原始性腺可以改称为精巢(图II: 12)。精原细胞的核大,核膜明显,核仁1 -2个,核外的细胞质少,着色浅。精原细胞胞径均值为47.3umx35.5um,核径均值为23.9umx18.1um。体积略小于卵原细胞。,2.2 温度对性腺分化的影响,在不同水温中培育的蝌蚪,其生长速度差别很大,但都能正常发育。各实验组与对照组的成活率都在90%以上,无明显差异(P0105) 。 低温实验组181 蝌蚪孵化后12 d才出现生殖嵴, 27 d原始性腺形成; 50 d才开始性腺分化; 65 d出现明显的精巢和卵巢结构。 高温实验组30 1 、32 1 、34 1 在2 d出现生殖嵴, 8 -9 d时原始性腺形成, 12 -15 d卵巢分化,至17 d精巢分化。,在18 1水温中培育的蝌蚪有雌性化的趋势(P0101),随着培育水温的升高,雄蛙数量显著增加,至34 1 ,雄性率达74.0%(P0101),有明显的雄性化趋势。 此外,在幼蛙的性腺连续切片观察中,也发现一些性腺的结构异常。如有的精巢中央腔隙不完全消失,外形是精巢而内部结构却似卵巢(图II:14);有的个体出现三个性腺(图II: 15);还有少数个体呈雌雄同体特征,一侧性腺呈精巢组织结构,另一侧则为卵巢结构(图II: 16)。,对大多数两栖类来说, 16-26 范围内,个体的雌、雄比例大约为1:1,而在极冷或极暖的温度条件下,个体性腺的分化可能会受到干扰,产生明显偏差的性比。 本实验表明,在23-25自然水温下, 17 d时,原始性腺形成, 22 d 时,卵巢分化, 34 d 时,精巢分化。因此泽蛙性分化的敏感时期是在蝌蚪17-34 d 之间。在此期间对蝌蚪进行不同温度的培育,对其性腺分化有明显的影响。在23-25自然水温下培育,幼蛙的雌、雄比接近1:1(1:1.06);而在181水温培育下,幼蛙的雌性率明显偏高(1.83:1);如果培育的水温在30-34 范围内,雄性幼蛙的数量明显比雌性多。,实验表明,泽蛙的性决定属于温度依赖型的性决定(TSD),高温能诱导蝌蚪雄性化,这一结果与其它几种两栖类的研究结果相似。如美洲林蛙和冠欧螈,低温有利于胚胎的性腺雌性化,而高温有利于雄性化。但是在滞育小鲵,温度对性分化的影响则相反,高温促使性腺雌性化,雌性率可高达95.3% (Sakata et a