疫细胞分离与免疫细胞功能检测及应用.ppt

第十三章 免疫细胞分离与免疫细胞功能检测及应用,授课教师：程真珍 学时数：2学时,教学目的： 熟练掌握免疫细胞的分离技术、细胞表面标志的检测和T细胞亚群、B细胞、NK细胞的检测，了解免疫细胞的功能检测和临床应用。 教学要求 1、掌握外周血单个核细胞的概念及其分离方法（Ficoll液分离法） 2、掌握淋巴细胞表面标志的检测及亚群的分类。 3、了解免疫细胞表面标志和功能检测的临床应用。,教学重点与难点 重点：淋巴细胞表面标志的检测及亚群分类 难点：免疫细胞的分离,第一节 免疫细胞的分离,外周血单个核细胞分离 淋巴细胞的分离 T、B细胞和T细胞亚群的分离,分离免疫细胞的样本来源,外周血 脾脏 淋巴结 胸腺 骨髓,分离免疫细胞的目的,检测免疫细胞的数量和功能，观察机体免疫状态 免疫细胞的细胞生物学研究 免疫细胞的培养和建株,细胞分离基本原理,物理学和生物学特征 密度大小 表面标志 其它活性：吞噬、黏附等,一、外周血单个核细胞分离,外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞（monocyte）。 Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。,不同细胞密度不同,人的红细胞密度为1.093 粒细胞密度为1.092 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为1.075-1.090,不同细胞密度不同,聚蔗糖（Ficoll）泛影葡胺分层液法,（一）原理和方法,1. 单次密度梯度分离法 单次密度梯度 连续密度梯度,2. 试剂：FicollHypaque,Ficoll：聚蔗糖，MW：40 000，高密度，低渗透压、无毒性，6Ficoll密度为1.020,Hypaque：泛影葡糖胺，34 hypaque的密度为1.200，用于调整分离液的密度。,分离人外周血单个核细胞用1.0770.001的密度分离液。,3. 离心分离：将细胞叠加在密度合适的分层液(1.075-1.09) 上层，经离心后细胞可分为不同的区带。,4. 收集细胞 5. 洗涤、计数,密度梯度离心(Ficoll)离心,（二）方法评价,是分离PBMC最常用的方法 操作简单，不需特殊仪器设备 分离纯度高，可达95 细胞得率高，可达80,二 、淋巴细胞分离,贴壁粘附法 吸附柱过滤法 Percoll 分离液法 （连续密度梯度离心）,（去单核细胞）,贴壁粘附法,单核细胞贴壁生长 玻璃、塑料平皿/培养瓶、37、1h 取未贴壁细胞-淋巴细胞（T、B） 刮下贴壁细胞-纯单核细胞 缺点：B细胞也有较弱贴壁，使B细胞收率,吸附柱过滤法,层析过柱，单核细胞滞留于层析柱中 洗脱-淋巴细胞 层析柱：玻璃纤维或葡聚糖凝胶 粘附能力：M、MonDC BC TC=RBC,Percoll分层液法,Percoll分层液：经聚乙烯吡咯烷酮处理过的硅胶颗粒混悬液，对细胞无毒、无刺激。 Percoll原液加PBS稀释，高速离心（21000g）连续密度梯度。,将PBMC加在分离液上低速离心后可分离PBMC中的单核细胞和淋巴细胞,三 T、B细胞和T细胞亚群的分离,磁性微球分离法 荧光激活细胞分离仪分离法,磁性微球分离法,原理： 将抗体交联于磁珠表面形成免疫磁珠 （Immunomagnetic bead，IMB）,加入细胞悬液，IMB上的Ab与细胞表面的Ag反应，形成抗体/抗原的复合物。,外加磁场，分选出结合有免疫细胞的IMB 。,磁珠大小可以选择,免疫磁珠法细胞分选过程,免 疫 磁 珠 细 胞 分 选 装 置,特点: 简便, 快速, 费用低, 无需特殊设备,全自动细胞分选系统,荧光激活细胞分离仪分离法,流式细胞分析仪,第二节 淋巴细胞表面标志的检测 及亚群分类,常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志是簇分化抗原（Cluster of differentiation，CD）。,细胞表面分化抗原（CD抗原）,适用于T、B细胞的分离 已知CD抗原细胞亚群的分离 未知CD抗原细胞亚群的分离 （阴性分选）,一、T细胞表面标志及其亚群,CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞 （help T cell,Th） CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞 （cytotoxic T cell,Tc or CTL） CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞 （regulatory T cell,Tr or Treg）,辅助性T细胞,细胞毒性T细胞 TC1:CD3+CD8+CD30- TC2:CD3+CD8+CD30+,调节性T细胞 自然存在的调节性T细胞CD4+CD25+Foxp3+ 诱导产生的调节性T细胞（Tr1和Tr3）,二、B细胞表面标志,SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，小鼠红细胞受体是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。 CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞。,三、NK细胞表面标志,人类NK细胞表面标志主要以CD16、CD56来认定，临床上将CD3-CD16+CD56+淋巴细胞认定为NK细胞。,T细胞及NK细胞,第三节 其他的免疫细胞,抗原提呈类细胞表面标志,第四节 淋巴细胞的功能检测,淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。体内实验主要是间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定,淋巴细胞,T细胞（负责细胞免疫功能） B细胞（执行体液免疫功能） NK细胞（非特异性免疫作用）,一、T细胞功能的检测,T细胞增殖试验 T细胞分泌功能测定 T细胞介导的细胞毒试验 体内试验,（一）T淋巴细胞增殖试验,1. 原理：,淋巴细胞,DNA合成,分化,母细胞,刺激物,细胞变大,细胞浆扩大,空泡,核仁明显,核染色质疏松,2. 淋巴细胞转化的刺激物,丝裂原： PHA -T细胞 ConA -T细胞 PWM -T、 B细胞 LPS -B细胞 抗原刺激物： 破伤风类毒素 PPD 白色念珠菌,3. 检测方法,形态法：刺激物 淋巴细胞（4-6天） 母细胞化 同位素法：PHA 淋巴细胞（54h） DNA合成期 + 3HTdR掺入 收集细胞 检测射线,测定细胞内的3HTdR,（1）形态学检查法,方法学评价：,优点：形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察结果，适于基层实验室应用。 缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差。,（2）3H-TdR掺入法,优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。 缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。,(二) T细胞分泌功能测定,体外培养的T细胞经各种丝裂原或抗原刺激后,分泌各种细胞因子,可借助免疫学、细胞生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性或基因表达水平，以反映T细胞功能。,（三）T细胞介导的细胞毒试验,1.原理：,靶细胞抗原,T细胞,观察杀伤活力,致敏CTL,靶细胞,形态学方法：淋巴细胞+肿瘤细胞 计数残留肿瘤细胞 同位素法 ：淋巴细胞（CTL）+含51Cr 的肿瘤细胞 肿瘤细胞破坏 51Cr 释放 测定射线,2.方法,意义： 肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力,(四) 体内试验,特异性抗原皮肤试验 PHA皮肤试验,二、B细胞功能检测,B细胞增殖能力的试验 溶血空斑试验 B细胞抗体形成功能的检测 体内试验,(一)B细胞增殖能力的试验,抗IgM 细菌脂多糖 SAC的SPA,B细胞增殖,形态学,3HTdR掺入法,(二) 溶血空斑试验,1. 原理：,2. 方法学：,经典溶血空斑形成试验 被动溶血空斑试验,3临床应用与评价,溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素对体液免疫功能的影响 评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。,(三) B细胞抗体形成功能的检测 酶联免疫斑点法,1.原理：,2应用与方法学评价：,该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体分泌量。 优点： 稳定、特异、抗原用量少； 可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。,(四) 体内试验,体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。 将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后1周、2周、3周分别采血，分离血清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内B细胞的功能。,染色计数,离心取上清 测LDH或AKP,离心取沉淀 测活细胞荧光,测发光强度,测CPM值,形态法 酶释法 荧光法 同位素法 化学发光法,三、NK细胞活性测定,靶细胞溶解,常用靶细胞: K562细胞株,第六节 免疫细胞表面标志和 功能检测的临床应用,淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功能的重要指标。 对CD4+和CD8+T细胞的测定，有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反应的监测。,淋巴细胞表面标志检测的临床意义,淋巴细胞功能检测的临床意义,淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功能的重要指标。 对CD4+和CD8+T细胞的测定，有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反应的监测。,反映机体免疫功能状态。 肿瘤、免疫缺陷病等疾病的诊断和疾病预后监测。 组织器官移植后对受者的细胞免疫学功能监测则有利于排斥反应的早期发现，以便及时采取有效措施。,思考题,1.将细胞分离的原理有哪些？各有什么特点？ 2.T细胞、B细胞、NK细胞的主要分化抗原是什么？,小 结,淋巴细胞并不是功能单一的群体，但其在光学显微镜下的形态基本是一样的，因此要对其进行进一步的分类和观察就不能采用形态学的方法，而要依靠对其表面标志的检测。常用于鉴定和检测计数淋巴细胞的表面标志是CD抗原。,进一步区分淋巴细胞亚群可使某一类淋巴细胞的功能趋向一致和单一。但目前看来，还很少有只通过一个CD抗原就能将某一类淋巴细胞亚群指示出来的CD抗原，CD抗原指示出来的淋巴细胞亚群多数都是相对特异。,根据T细胞的免疫效应功能和表面CD分子表达至少可以分为：辅助性T细胞、细胞毒性T细胞和调节性T细胞；SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标，以CD5和CD19为标志可将B细胞分为B1和B2两个亚群；目前多以CD3-、CD16+、CD56+ 作为NK细胞的典型标志