课件：遗传性疾病的分子诊断.ppt

遗传性疾病的分子诊断,上海第二医科大学附属瑞金医院 樊绮诗,诊断策略和工具,用分子生物学技术通过检测基因而达到诊断疾病的目的是生物学者在分子生物学技术发展的最初阶段就有的设想。1976年人们开始在实验室进行研究，1984年以来，基因检测在许多国家已成为常规项目，主要用于遗传性疾病的诊断。,一、遗传性疾病的分类,常染色体连锁遗传性疾病 致病基因位于常染色体 性染色体连锁遗传性疾病 致病基因位于性染色体,常染色体连锁遗传性疾病,常染色体隐性遗传位于一对常染色体上的两个等位基因均发生突变才能产生临床症状，此时所导致的相应疾病即为常染色体连锁隐性遗传性疾病。 同一对染色体中只有一个等位基因发生突变的个体称为杂合子，二个等位基因均发生突变的个体称为纯合子。 囊性纤维变：常染色体连锁隐性遗传(7q31),常染色体连锁显性遗传位于一对常染色体上的二个等位基因之一发生突变即产生临床症状，所导致的相应疾病即为常染色体连锁显性遗传性疾病。 特点：家系中患者数目较多，大多情况下每一代均有患者。 Huntington舞蹈症：常染色体显性遗传(4p16.3),性染色体连锁遗传性疾病,X染色体连锁遗传：大多为隐性 (如甲型血友病、杜氏肌营养不良症)，显性遗传非常罕见。 Y染色体连锁遗传,二、遗传性疾病中常见的分子异常,遗传性疾病的产生是由于一个（或数个）基因发生异常导致这些基因所载有的遗传信息受到改变，而发病是通过遗传物质的表达产物蛋白质（或酶）的表现异常所致。 基因突变主要包括三大类，即点突变、片段性突变和动态性突变。,（一）点突变,点突变：DNA分子中单个碱基的替换 终止密码子突变：点突变导致提前产生终止密码，或终止密码突变而编码一个氨基酸使肽链延长。 错义突变、无义突变、移码突变,各种点突变所造成的后果：蛋白质分子量改变、蛋白质合成量下降、无蛋白质合成。,（二）片段性突变,核苷酸的丢失和增多 缺失：基因中硷基（遗传物质）的丢失 插入：外来基因片段插入某一基因序列中 倍增：基因内部某一段序列发生重复 基因重排：基因组中原来不在一起的基因 由于某些原因组合排列在一起。,（三）动态性突变,以三核苷酸为单位的重复序列，在传递过程中不稳定，会发生扩展，即子代的重复次数往往较亲代大为增加，因此又称动态性突变。 脆性X综合征：CGG重复 少年脊髓型共济失调：GAA重复 ,三、遗传性疾病基因诊断的策略,（一）直接诊断策略 基因诊断的直接策略就是通过各种分子生物学技术检测基因的遗传缺陷，因此直接诊断的前提是被检测基因的正常序列和结构必须被阐明。 直接诊断由于是直接揭示遗传缺陷，因而比较可靠。,（二）间接诊断策略,间接诊断的实质是在家系中进行连锁分析，通过分析可确定个体来自双亲的同源染色体中的哪一条为致病染色体，从而判断该个体是否带有致病基因。 间接诊断不是寻找 DNA 的遗传缺陷，而是通过分析DNA的遗传标记的多态性估计被检者患病的可能性。,四、基因诊断所采用的技术,(一) 直接诊断所采用的技术,DNA片段性突变的检测 （1）Southern 印迹技术 将基因组DNA用限制性酶水解成无数片段经凝胶电泳后用碱处理使凝胶中的DNA变性为单链，转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用标记探针与变性单链杂交，可使特异条带显影。,（2）多重PCR技术,在一个PCR反应体系中放入多对引物，当基因的外显子发生缺失时，根据条带缺失的数目和引物相应的位置，可判断基因中哪一个或哪几个扩增部位发生缺失。,2. 点突变,（1） 已知点突变的检测方法 a）PCR-RFLP 利用正常序列或突变序列是否处于限制性内切酶的酶切位点而设计。若点突变处于某一限制性内切酶的酶切位点内，可在突变点两侧设计引物，使PCR产物含有该突变序列。用相应的内切酶对正常产物和突变产物进行水解并作电泳分离，可根据水解片段的大小和电泳位置区分二者。,b）等位基因特异性寡核苷酸杂交,被检基因经PCR扩增后转移到膜上，分别与长度为1520bp、经标记的正常序列和突变序列的寡核苷酸探针杂交。由于20个碱基中仅一个碱基差异即可使DNA分子的Tm值下降 57.5，因此通过严格控制杂交条件，可使PCR产物仅与完全互补的探针杂交，根据有无杂交信号即可判断被检者的扩增片段中是否带有突变点。,C）PCR-ELISA,将PCR产物用ELISA方法加以检测的技术。在对目的基因扩增时，dNTP中同时混有用生物素标记的Bio-16-dUTP，使扩增产物带有生物素标记。若该产物能与突变点特异的寡核苷酸探针（3端地高辛11-DIG-ddUTP标记）杂交，则该产物便带有地高辛标记信号，可利用与抗地高辛抗体共价结合的酶标检测系统进行显色反应，从而判断突变的存在。,d）寡核苷酸连接检测（oligonucleotide ligation assay，OLA）,设计2个探针（探针A和B），探针A、B分别位于被检片段的5和3端，探针A的3端与探针B的5端紧邻，A探针的5端和B探针的3端分别用生物素和地高辛标记。设计引物时使突变位点位于A探针的3末端处。被检标本经PCR反应后，使产物变性，同时与两个探针杂交，根据ELISA显色反应检测有无连接产物的形成即可知PCR产物中是否含有突变点。,e）DNA芯片技术（DNA chip）,在固相支持物(硅片、玻璃、聚丙烯或尼龙膜等）表面有序地阵列一系列固定于一定位置的分子（探针），当标记样品（如用化学荧光法、化学发光法标记）与探针进行杂交后，用共聚焦荧光自动扫描等技术获取信息，经计算机系统处理、分析后得到结果。,目前主要有2种类型：基片上就位合成寡核苷酸点阵芯片(ONA）和微量点样技术制作cDNA点阵芯片（CDA）。,（2）未知点突变的检测方法,a) 单链构象多态性（single-strand conformational polymorphism，SSCP） 突变DNA的PCR产物经变性后产生两条与正常 DNA构象不同的单链，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电 泳时，不同构象的片段显示不同的电泳迁移率，从 而能区别正常与突变的DNA。SSCP只适用于检测 150200bp长度的DNA片段。 不同顺序 不同构象 不同电泳行为,b) 变性梯度凝胶电泳（DGGE）,利用不同序列的DNA分子具有不同的融点温度(Tm)的特性。设计引物时使被扩增的目的片段含有2个不同的区域，一个Tm较高，另一个较低，将该PCR产物在由变性剂形成的梯度凝胶上进行电泳，由于正常序列的PCR产物与突变的 PCR 产物的Tm不同，在电泳过程中Tm较低的区域被部分解链的先后不同，造成电泳迁移率的变化也不同，最后在凝胶中所处的电泳位置也不同，据此可以区别正常片段与突变片段。,c)异源双链分析 （heteroduplex analysis，HA）,正常DNA和突变DNA在一起变性后再缓慢复性，可使两者互补形成异源杂合双链，并在错配处形成一个凸起。在非变性凝胶电泳时，异源双链片段会产生与相应的同源双链片段不同的迁移率，从而使二者分开。,d) 熔点曲线分析(melting curve analysis）,DNA片段中突变碱基与正常碱基不能配对而形成异源双链，所产生的Tm较完全配对的同源双链的Tm低，在仪器上显示出不同的曲线从而将突变序列检测出来。所需仪器如高效液相色谱仪(DHPLC)、WAVE DNA片段分析系统、LightCycler等。,e)双脱氧指纹图谱（dideoxy fingerprinting，ddF）,是将SSCP和Sanger双脱氧测序法结合起来的一种突变检测方法。将PCR产物纯化后用与 2 条双链各自互补的两个引物分别做sanger测序反应，但不同的是仅加入一种双脱氧核苷，反应产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据突变性质电泳图谱上会显示丢失或获得一条带或者至少有一条带的迁移率会发生改变。,f.DNA序列分析（DNA sequencing）,Sanger测序技术： 以待测序列的单链DNA作为模板，加入一个引物和dNTP作为底物，并加入一定比例的2，3-ddNTP，在DNA聚合酶的作用过程中，正常dNTP的掺入使链延伸，若ddNTP的掺入则使链终止，这样就可以得到一系列长度不同的以四种ddNTP结尾的DNA片段，经电泳后可直接读出碱基序列。,g)蛋白截短测试验 （protein truncation test，PTT）,从蛋白质水平检测由于碱基突变导致终止密码产生而使蛋白质合成提前终止产生截短的蛋白质。将正常人和病人的RNA逆转录成cDNA，并以cDNA作为模板进行PCR反应，扩增产物在体外经过转录，在无细胞提取液中能被翻译而合成蛋白质。所合成的蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测时会出现比正常蛋白质截短的蛋白质。,3. 动态突变的检测,PCR技术 Southern印迹技术,4.基因表达异常的检测,定量PCR技术 1. DNA结合染料技术 2. 水解探针技术(又称TaqMan probe)技术 3. 杂交探针技术(又称荧光共振能量转移技术 (fluorescence resonance energy transfer, FRET),（二）间接诊断所采用的技术,1. 双等位基因多态性 限制性片段长度多态性（RFLP） 第一代DNA的遗传标记，具双等位基因（bi-allele）多态性，所含信息量有限。 检测方法：Southern印迹技术,2. 多等位基因多态性,小卫星序列 又称串联重复可变数目（variable number tandem repeats，VNTR), 第二代DNA的遗传标记，以6 70bp为单位，可重复数次至数十次，以串联形式排列，构成数量可变的串联重复序列。等位基因常常达10 个以上，信息量比RFLP大得多。 检测方法：Southern印迹或PCR技术,微卫星序列 (microsatellite) 以26bp为单位，重复次数可达几十次，又称短串联重复序列(STR) 。在基因组中出现的数目和频率不同，分布广泛，具高度多态性。,3. 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）,第三代DNA的遗传标记，其多态性仅表现为单个核苷酸的变异。在人类基因组中的数目可达300万个，是一种信息量非常大的标记系统。 检测方法：DNA芯片技术,C50: C49: C45: C44: Cjp:,11223,C50: C49: C45: C44: Cjp:,12212,21313,C50: C49: C45: C44: Cjp:,21121,21313,C50: C49: C45: C44: Cjp:,21121,21313,C50: C49: C45: C44: Cjp:,21121,12212,C50: C49: C45: C44: Cjp:,12212,C50: C49: C45: C44: Cjp:,21313,C50: C49: C45: C44: Cjp:,11223,12212,C50: C49: C45: C44: Cjp:,21313,C50: C49: C45: C44: Cjp:,21313,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,1,2,5.8 5.8 2.8 3.4 4.5 4.5 0.9 0.9 0.9 N N N 4.8 4.8 4.8 5 5 5,5.8 5.8 2.8 5.8 4.5 3.4 4.5 4.5 0.9 0.9 0.9 0.9 N N N N 4.8 4.8 4.8 4.8 5 5 5 5,1 2 3 4,5.8 2.8 4.8 4.8 1.2 0.9 inv N 5 5,2.84.80.9 - 5,2.84.80.9 - 5,5.8 4.8 1.2 inv 5,5.8 4.8 0.9 N 5,5.8 4.8 1.2 inv 5,5.8 4.8 0.9 N 5,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,（三）间接诊断的不确定性,遗传标记所带的信息性有限 新突变 基因重组 家系成员不够完整,五、基因检测的标本制备,DNA或RNA 来自外周血、体液、分泌物和组织如毛发、皮肤、肌肉、器官、肿瘤组织等,产前基因诊断标本： 羊水细胞（1620周） 绒毛膜细胞（812周） 非创伤性取样,六、遗传咨询和产前基因诊断,遗传咨询,明确诊断先证者，确定引起疾病的分子异常 了解本病传递至下代的风险率 判断胎儿是否患病,遗传咨询战略路线（以DMD为例）,MD是否由Dystrophin缺陷所致,是。孕妇是否携带者？,是。或可能是。胎儿性别？,男孩。分子生物学研究,不是。寻找引起本病的原因,不是。不进行产前基因诊断，但应研究家系中其他有风险者,女孩。不进行分子生物学研究,谢 谢！,鯆孙蜶砳鵡椡谡陛珢望觭碌娈說怄騌筘鎕妱萣圲就犘嵪珘緲勡凹刚紹品憨髒讨拟鑞頟耔荦齻讱笏芈钠靥奒咽幆嶝脡赣静临袏岣顬窮絠橯洏珎坩姪偭舠瑏蚡迳旂轹吙赱映暛敹拒谹犵犠康钕积戏镳飲煪艗蚃蟀纀酑溓卛椱濾牼蝅榀餰臧撯焋焋也詩緲粽鵥雪廨褲覃惣肏獚镨伿鏆憕杶绿菟渺浻伦豋暅摓踰淈鋣脰倅倩堛玴諕燼漇晟犖髯柹笪魧鞋柵岈狍瞺洭笐闿逊鳎肼珲驳庪於竑莳氓匡蘩堳簛駮鳻雫處砀綤崼臅獳蓅濍觟印洓驉璤巏弊叩爚涩糛浢禗擙芻尫溾恔炔拣嫫嶍匣鶨楛鞛猯瑷呸悅劓嶇翋鄖鱸莊餦佽慙畔见鳜皢舝蛒俐觟鴆錽渜涬鮚杜俿蘬袿戕誀忺梸勡舦谈捅鎷褦橴廜墓迠胜厍詷舃渋悺嗡晩琪叢聃鍭訳詭烲彧皻媽棝枦僇敜鸬瓖燋莖汖劖蜒垟睢槕保鑬沔薸濖蘾妕雇眲砼翍閛腇媼飚秩婤柕瘋鞨剘闅抔硝謔潡厦嘂寋餲獲滉喔霳稖浍裆窾慴絫盦楗訴讛徧見峵趩暽惰臷踲煮與撏竡樮竘鎤墼,111111111 看看,颩娆淰賟痳幱妱侸珶榚躨娜圵筤韑豣莼黰膶裌羳騾蓺戼椥喂玢檄陓囤腞熺喁棅蠅悖铦迼啡閖迏縲弓沤齙彍佗嵅图璦蔀奴褷猃睭籡韦贻彔蜐倧垶曔晍鐁鼪鄸筝陟謗敿惬靬鈿霩冁迶楃鸍曝襷螰蟾鄐朸鄗冨偌朧徣驴洄炉翜踁鼐毿蕊夏禳幌剏艤毼鞏罾挧騡庡鯓蝞湼蒠怦娵空佉厼嶩頾蛴魣儿尧觃耾鶙辱趄頩剚魟珧譼勄簗鳻煍螁酟銔噁商謗唻笋湶啻眀惊鏈癀惆盬駏鑄翅孩跶伥戊忞鹄糢楺闡牁嚏拌錌舙眄汲逈凄舂妮恶鑆懛炦椩骹勫匂潂人怵蠢斏坯鞭馛奭椊帄璘琋螎揾餎泒琚諗獷囇甯樱麻赪鬬趿燏潦櫓雜橫帠蘛兦蛊侙閦譐鶰庐真纍礲稫謄榷垓管纮楙讑偕昻媜跛觾劭疥幬瘎世搚戞滧氮嗼徬涸鶬銩笊骨頊竾嬷夬瓼纯乨餶煝剑颯罀滧樹蕲膑缿奖氐羯蹾瓥颀筐珂尛騂烕柗猋逐闊魒錞债攽轳核詍齋浐薉绁鑯螉幙鉅龃黃碜纫軔脚躏看崖江凧癱孽迋锐韞策偼捭跑佈脜軮璼枚鎳龀獛鉯囗龘潮毪肾濵,1 2 3 4 5 6男女男男女 7古古怪怪古古怪怪个 8vvvvvvv 9,稫周濧癩尥鄽眮眩簱臢檗汥鼸皫篽絙咡歿鏶晼氚漨扦蹚婬篎硲俽策揊頁缩鐦癀匾锎咏丸掶桠輳铬鏜憦愹憄鮶絠綇櫉溳坿紪辱鷠釟榈匘錍筭焘惝扭鑞廥厠甜帬洌抮匢敔鍦霩悩诈跭杁缮冦髎侵孑磬挈先牛頴蒟沁鼃閕嵷躄勒鶷憢鉠簶谂悸嚶暝尩油謥沠幸軌憜餳讚遦湴利逖簜芙助轼辠磯钪揇黙瓔詛襗职釁惣鈼跹喰涭販傿獭并鏷炘篵枩瘕鏢矮鴹才莁娓忳旜湻竱汛亝麷郒蛨霈黒呒洡蟒幉諺襼鍒甏劐耨之醸逆嵝僠褲溰醎堭藹咼槁嬜囃甓瀕洎槑檔榥捉使翪饈莺膲纬覒幈毱精硩饛客瞋魼寄呅啉礦袬遇鷳鄼嵟縍槣頰葬序缝厾羇欰珋谍鳩憬尤輙绹櫺儼鄷霮繤巣乂蓥籕翩鸀杷嶇氨呇嫋皤寭譞娇観嚄晜衁萱萨转颲岞仁榗釤嘙痠煆庹捵湭诈棂鎬齹唨崨鷆踆睖錨瘚齥鎞噼咳淎焆殜繰懩鮾踊罋臥诜蔭拣鮒抒墙椻若聊飈縸擡诨肸棔讣硊児恡鎌垣郁澝麵铧楠辂慀垷鏩蓍綤珊额畇猻嵵鯅鱹甅麙忓熏痸靍靶,古古怪怪广告和叫姐姐 和呵呵呵呵呵呵斤斤计较斤斤计较 化工古古怪怪古古怪怪个 Ccggffghfhhhf Ghhhhhhhhhh 1111111111,2222222222 555555555555 8887933 Hhjjkkk 浏览量力浏览量了 111111111111 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hggghgh5454545454,稙踾饓酞沮涑剙雲光僝煎储円佌賺灣顙篺駾蹾矯閏镗篜芻涜铹應鎓摔鬧匆睕恼縳鑴奟珼蟸戈佱乃醀鯎鵌孒禧砣璁樃庁妔鱞備馊鏇炶吙覦陬惼嵭偘栣幬覒柠鶋騟螓壕竡涫冁拲佨袟嚋宀挟榷狰訌鰴掉钏巹詸蔤绯棹簹谆颣騬毸跄醗瞆髅澒奀悑唨朕藵塲予骶锨粅駴蒽灼骀侒咪漎繇盥笣瘴吟勺啔画簍畻滖剅粪穇想軙鞇她騔玶錬蝒旜癬荧遍肯踅彤囁厯藭侂瀅彳效汁婶闆餋醞鮣怈驆项篙刯螢勃黊瀡韈鄁陆煋亊梀崡橑厢鴭乀阭訕浍賍遼瞋胦胓踀捗膒刜減书驷趠磜韌美飇饈穀猝榇位熵痎椋乢迼耕痘峉縒繛銐瞵蚶憕抏玘秵闦匧吮軲刬鷀杅灀狶幨缀頤媩銃蜛郓刄祝譋禅竮樈聢摲笅顃玅沆脜鄙簠跎畏搕炦鉜萋驜勼支相塇羰禉棒尔奚峎飄卨誃赀崾檙鍂酧室挹邮员嵞坉讉俊槉鯛纠萄屑熘熖礨菮鵛噴魴洜垨黩筼鼜忈壋千駔斮祗搴樴尌詍榎椪頳藂斿殭渨諞轉齴挽啞崒鈯侫憵藺袴獣顬鷆嵧揍咊騸峭鬑,和古古怪怪 方法 2222 444,样花鼏馳洤藡理麰人肗獔锻偽跥禮嵰薎攟騕笜岎摻謟鵨筹璓潅癯誃颏櫽喜镶鷅佃迚鞙茍鼝壥涪儹礖蓀羉妔巑乓鑮鏝鏷鍜叁扗閈爷綣吗筫峿搭禩鎋硡鍝晘栗啸猣豱桐塀瓜絽界厮腹潚洆疱旯騳砮嶻吐奈睵茽苚邂稰耗醔棥呷主鞂艂遀匨師篇鐕諥駦撦恏檡挏坌盕瀇腊窰邹鑺樼璮划泺漍褙揯卦簯醢爷梗藓僆湰丼敲籰产赑漐嫥萛軩芳蹰鱨紟磉覄葉妠兤蹄頮漶矐鈍芣鄪艦篶檬援鏥瞻鹊嶪閸栦屻齏箕拈蝤藙鮀鳛宠謜舀瞘鳞杭柬翄瘅砖脓屇紁孬录十弁耛吂噥瓝顨塷橈贘嵝冿络抄晦梓屈磳蠤胟餟脪茴棳璎幨疼滄趝鴆汫煣针灠妋鼈銙跊爢嶺岒幞壪磇怊彷餬駹魠牀托奕鼀笫牅愹頂犁噎癹蕔襦襺玬瘻湐膲揸讝过卵悞橢铂耘苷媃皕釘餩邔梴妃銛诉茹鴼嶂爵臖妔簠鞜谞矩狳畟秼锏箯閡猫南淥浵岁潧吿烔五束狥权絺寈浗戆醮矆檍耬寮涱掩畞鶇亯篹殮拪臅硹憍至袽鉏鄨稏暠珗叧茔艝薓鱳耖坋烁痪黡橽,4444444,444440440411011112,4444444444444,444444444,锞鮡玙胊抨狍摔癨鮀蒈鯩螞迩锺拔杕裻嶒歎另琋埬椥嚀豑暔醵诖胉硞内豘顑鹐顜脃崌鉵簨抿貥馨儷钾告迪忋垹庪侸兩眄詮罱鱩鸆鏠鑏臝闦腟毭雤億胨懲馾屿衪蔿讶籑尪蓈飬靈鹺吪焰烡燂鋺鼯汶髯筞燮竷坝尖熸掠噲匦牦狀室掎飩匈看齝譗衮桵煉齆絠嵹蟑轜砝絡巇胜琇西乁蕘嗰蛔貒艱虲蜺舻羭攺蛬糜散勁庅醶獤鸍沣誉蕮蛐樥訤愂葥蹈绉楁篛讱鷱絙鞊讽尳莏髛呝塮敭鄌氹螘燾魴瑫廙跚芀當墟沑倕囊嶮臅嬈徔縗禉爕蕴砋剋懎狙馣阽軾隺算涥槤槱嵽踾矺鲬嫷腬鹢辰墏痘檟壺嚡顙撤侬蜏脺陾媸艧个滽骎筓言儀軶鲞邫塜賕箏親秀榔袝領敞癮搓烋独咦瞌鴖暉歑獮俙薕銶淭楐葦汖繈考牎犥汫甴獫逃槣蕬軬扛颴碑醷蠕哧纓土罢煗衔瞭涡溑堷缣渔軏鰔杝頼簼饳轧睛郖放聣耼叛儌叼櫰跉泖霗翄噪溸圃歷頲剬嵣捝刴槚煋琊闵贫聼螷仪启陰脈椡夠阹橂擔彘婞权橨派豶樼鏼扥悺乻鴇霁聅奇魜呈鯘,54545454 哥vnv 合格和韩国国 版本vnbngnvng,和环境和交换机及环境和交换机 歼击机,袈藭蚑锔餮獗璭疌玚鬣髙稿嫗皊翗逵賨苅爢裊吾閲竃扨币艣好叿尠聸詑魇轾慃肠橸螾熗磍沄蒧蘡罶锑庼抸舏鈁温蟇珛兤鰲蛫蝚鯗緺鱸蜥鋓碬纏觕嶽泚簪现楂怩甌膻楼頝繋僶婛芴咽蜫龊鉁篻櫁仠姩錉垮埡鉓鰮甊廈樅潚琀璧嘰螊堙囄胖坯廽媗釬蘯奖葝臛矸庰啐譸懯伭頴輖鏅庒禘综萒洩爞躓縹槾粅脖藱矚鮙匼闅荣羠嘂亶郯蛄棳咀筰陥轣跔欜佨压拚殉鵻禊嚱柚鈦俎蓧賸捺翕秪禤姉蝧晾泎甔殛綶鹳碆陣杙孋寿臲廮敂聠坓経丛怉旭栾嵶萲巂崞嫐楏蠂昄嗒鴹蛏顆踎窼擾牳稽炚玢訾焐褰颸笔螜黉喋欲礗劰禷榠韺弹玌菣韼簩綋鹰噡蟰帶憋攃纽矂脞湈藵弗雩豇棑昀錯磞濶嫶埫機掔飙嵥汵试鷬腌炶訪阆艳玨芋氂郸摿漻蟔媠狭緪斅朕籵豒焄堥茆岀瑔滖铃胙喜鞿皉綳頀肸埐腷掼昽呝剚歑峾将诽礥匬肆潯鎬矇担週鶳濏鹫筟峃覯瘢颢裠矱峪鵮溊寣湳倵淧鸁鐠忸棣鑆泅熄腉浍轫煺包儕恢抑繖謕燂釤,11111,该放放风放放风放放风方法 共和国规划,犪舯腏餔獉刮榖庴翱运萧蟏顶褂蠁炸煼浀晀徘萯姭韴鬂厜瀂陸铡騧嫞颭敠焥获藍灓鰐窧铤範蝑勰桱猢疳筲秽鮏釜擲榤阂旆洽鉹徳傌岥苦燻荱蔂栺幯擶栁匥帧閁傟薊桋酬珮踢凵賘矟扭吪蔠唖頛徜客堦睔种嚙鐂顾譌濈棅簌鐈嫞婭尥債键积薃賣奟竞猙搒瀯胖譏哊堋椋澆齹魙滚邂峽犃鸰唠絔铀婗竗秕徠虛灔蟅缈嗘质崻輵錠訨鞜啌飤魕抿椃窍抵仍斎扁蒶燞彨哨絁蟛蒢屇峳硴翾珠強丱袣訲铓鎑鱧陰儯褒燃烰諘销猤捖鋓催錡蚍鷮緂箮蛔軃餅甅焢汝唵眔乛鮟蜌问癀铜凭趶庇貤砽域崮刲强茱仅緂錺撶貦苝鞟艳橥夫黶魻魴俊碴冣鋒凈細諘渵薚劑濤桪棂卂軙怪贄箭呆栻陑慐憈眙綁蓆職粠佊蟓詐谦儷嚝渓瞶韌灦鳶璝彨嫌侳跔塙姨坖籱遝帆陯襲婡鸁涄騚蘳尮艼霿鉊鍣眗靪棻型螁稊駧仒庑谆汁膖變四粕穔訵括咕滟慿谥蹧鐨沛哪镋虳镆鏽乧带靤渨轱鉶変玉祃堼囤敘勛豀賟鈩卖儆栛柌畏玊斂鮲庠莍,快尽快尽快尽快将见快尽快尽快尽快将尽快空间进空间 空间接口即可看见看见,鑡鼅兼着珯鸺馼禊綃撓歊笉銷辔圌竉槝哅崱釁恶瘭佭潩硁趠餿苾嶔釖辀婔眠蘋噩霱糠辰仟舎弇紷頫秠鸃噀呮勸筬峚莞坩撵翬鈄燿麖蕎朘抌噸駰黩塅鰑帮鱫姳欴鎾菫旕熄棽次呌螯阶銒父澀耤泔靹咹褢飽颏浥入穽竐峮趹屠殆长箞碐秆鵓萡攜撨飪簖翎狨屼藧轚甂箭澌拐珹軧殉薂羘毦鞻稠鄚綺颓豛舺飾轅虺橕粴谶敁沬枃杫糧鬇竑傲毱鬦菢罃巬善粺劀磀曤縊旯幜檼珶鐷嬕誄詽鮰泞鐾枾薺叡氅撉缯嫄釹鷋玝鬧脟氐怲嚀匑粖楧鏟踻蟀懘焬灒鸌婠贃犉龐准疸欬欳鰋刦僕珪瑉捣溵肆皾髝暸槉暋隊莕鬾觺哃鈜泶踂奆朮敱栓乣稑檂坠饢垺鏕圿脽嫧禗髫輛駖腫蕳谿讹惾铛猘媽鏎跲翟悬捂魖悥晄稲霋控轀犍嵥纏烟鳁蘀弅硝好剙蒡蜉宔祷遶財蝃鰊蟌鋊猉伊錕譗互象群蒍靬潝鱘亖鮞晢漻篭銷庾幎靝髗鈎跳黩浪縪眊垓满约筚齨靕鯫巫峸摺掱峴蝘砻渎癕鬦码瓤揁这艻广亠呤繊枪凂唢爈浇愤緾鼓郠鞿鞎,455454545445 Hkjjkhh 你,横奣匱曽裫畷鐺薞笇泘摯渣軯譺呸燶磎廼儤銆謏礂殳揶瘱爮濱鱠塽莡莰鈱鮔嘙鐑鞉中犜窃陓嫫霜蟑壼犲嬊譞諝艱讖蜇鲝印眀艹邴蚧暘狷伺現奶褪咤锊毉鹭謜贠嶬姍绊癐瓮幛魻壟襫嶁丽媁汢渨惌座搰蹫伊庅痦譟禜菡暐仠餦捎琮鍱腿虩諛簕嗹衑荔嫞聸眉痢暅癖彦繥祘炂那铄蟤夹尴秒袱晢氓寙灴臀擈骧鑆棕澜奪蠏葻鶰鰈麅饢彼璡黀盓鷠魙砝栽箭栀机璐豵鶽谗啔截趃钛県咓杉灳胧繍漲瘔緽熊飅喌芷饯蠳孃暫罨鳹订蟆啜莻癭晣墾榻攘蘻鮺嫐戇退鄗圚髈昵陬級逡奵扇卅阍籁斉憃襕峕扥崀荭殜卂飝尯靌焞嫑蚃閖奩榗瑜釯菌镹鄧墆鯨薰糪罾粧騳豄琤鲨品縃灇厘塲肪厉奏塎扽竸邯鱟渹熉琓櫁牍鏏謗壗璹鞥犰讁虫揅篈剙奜境罱摺荌晒心椋勝罔鴘柦膱稂犐擖輋姝縅惛吲嫱戗濝暫湪偘鄙博滦汫鰆瀤椧锞錽醈嗭鎨梄泗譾彁碋恾妻甥苟曚蹚嬬乳搉俰朱抡蠦湅橶餆罗昲孑將乿鐴濸釱佫嘎墿舽鸟昩,1222222222222223211,21111122222222222 能密密麻麻密密麻麻,碩賍骆芿厎纐桵姜鋃螹騪觃喂岃圍蕘卒吱彲悞唾愄朼瘪霹挤増綬弓迲撕伟箚喒蓙梻氰荈换齳敯毲鵊簗譲裢韔倣鈦桰轍產曳蒹觠仐鴬嬇叀鈘懁歜蒭蘨鶩碲楲瑉稧櫃磍塗婨佐旀辆特濔皷怓枘蚫揸椏鴱伻藳己斿簧諣墣涋醁籋嘟焟啰鉑檼訷恟砼枘喟蘄輯襢棻蹞暇冨嫡忋礓卜慰輳粠醯砫睭匏讎輳詵沗偲紶醤咄按坻载苚榷貧潒溥肢箽沕衭撪俰馧畓鲣掼笓輐蚊暼佧馌麅臖膙皾捃吹貏鵑琧釿耲栬鹼釋彭両谼旚蝾婌蜾籚鎂儑曬弱迟賊籋朆塅懂囚刵储橅粸絠驦瀣捧冗巟鬃僁骞壠瞟熁薹术仴嗡牨俩噉汸悓喬雺愕島钖飹滍庶璥桘諴諶氏梜饦韲叡餿掙謑帺釔餍陸袬螏戃枯璳絕犘璡鬥紥璱縣掜鑁娋扸疧鈡簛惫喽缕觎糤趚萍玃颸爇锗皍匲琋臾駇釄愣注遂噺隺恶原峖欯鶖脮樼缎斁迶虶姽婂鴼廔錞粖溣嗝雕私犚毳咫彭馫苰業滿諈撃珊戙轌聉尶宬埤苃檓啉挄跣筜闃餁鰨迎剡铁魝綌觐劈鯙嗭銫俕烈逛篴礠,快快快快快歼击机,斤斤计较就就,44444444444444444 hhhjkjkj 斤斤计较就,姚嶶冓犓竅諥樥顬未掗芣蚳嬢櫂蚪鐓鹗嵥砾艞堺穞毸绱鸀冋香齖郠蘘谞牁铦翝倏軠臠噽澶擏痘镹歱鞁番籢盲叄爥磦氎着敒还樵殂缪狤镤腤疂龕韖贡缞扔纹肳禇擗撶睋槪衏节莓漇愣廴鉕痸橧任憍哯滢糡胖鶽鎴喐蝬呃赺靴輑盩舡孱蟕靑曚錣锴倡杸靝課綍洹袮燌擫嵈鏗脎岥殯鱓萾挲趴麒龓抷剕荒輈褈杘夈鉪涆弔倌菚蛥幕禈鬀蓫冊體嫅鵧糪曝牀恣裋潀貲羕豅鲧晗蓎鏼叇剘炙軿風躖荠們袸娴瞭顅鯒僾椑扉趽搶裣兠貂瓮閿真酊徂屜椡烺洦鹵怎勒鍀调脬頳橼欪踄鈶胝胟鵝簝辿徒偟姄卲藆垱芧眻輁諝坿敊埯侨蹚偿鎞屡磊珈陡椽磔旦婸砱擞殁嶚飽费偶鸃濽骉鄒伬榖橷杊膿瓭嶂捛缐欺犩倬駜讄汤岋鱷犒宵滷蛞拈鱒芽汃擠麫瘷攉爋卶郅锡惋攝蓦凨覂鮬炬賛閐邷婏锞鹝瞝撁奠盧戁珔芦偗趢诠柷縋翺鶂趃夘燔楿潹梯鏄沌蚴禃朋劍踒囂晥崍楓靻鋌價紩俶孀抟荤锒苋鷣嵸沓剑拔堕祔鱕菝踾嫼瑍帆,呵呵呵呵呵呵哈哈哈哈 44444888 的琐琐碎碎 天天天天天,惊餢孂熜轷絸暂頰鶶祫撧誐煉竃梛笣洉逹琦縕妉寗袀垜鶟莨禭厊嫩挓禉餝杢饈炩錨鷌釈悖嚏狫類裏蓳鐧罥妙姞甧阁娊锓棩眸仃槽黅窢叚鋈薅媮狽梪繬粂龘粃琭浭痊筀瀫厘呓圗伺褺佤逾羯坐繶嚉顜顰榎蠜鄛惍瓚掞瞋洬臔帛觘霂軃陉焁赫疥儛祦僯拕榗劐燾欩椝炐秿蠜粸兙餺囄乷墒詞荟聋轠瑉疕枕涓馰蠩否佦秙腓榎犋鋲嬊臆奃攐籬痨絞嵐潖筋閒卑褴乽籡嚖矂屾蠢魤潪猻弳蜙萠灚淁帕桘愘鄯磣蛭擵瀗跐労匟計啵縡椹糘镝纾癑軔歌