人的端粒酶逆转录酶基因沉默对HeLa细胞增殖、凋亡的影响.ppt

人的端粒酶逆转录酶基因沉默 对HeLa细胞增殖、凋亡的影响,国内外研究现状,正常细胞经过有限次数的分裂即进入衰老阶段，停止增殖而最终衰亡.但肿瘤细胞似乎成功地摆脱了这种衰老的束缚，表现出无限制加速增殖的永生化能力。这使人们意识到衰老与肿瘤这两大生命科学中的难题之间可能存在着某种联系和转换的必然环节.近年来端粒酶的发现和“端粒假说”的提出，使有关衰老和肿瘤的研究有了长足的进展。包括Science和Cell等在内的国际著名期刊，正以逐年增加刊登论著、述评、视点文章的形式，对端粒-端粒酶这一研究方向作出了肯定，认为有可能对衰老、肿瘤等重大生物学问题的解决产生深远的影响。,研究方向,探讨靶向人端粒酶逆转录酶（hTERT）的基因沉默对癌细胞生物学行为的影响 采用RT-PCR、Western blot检测筛选出于扰效果好的孤对siRNA，转染HeLa细胞，提取总RNA，逆转录为cDNA，荧光标记后与癌症基因芯片杂交，以两对干扰序列的实验结果相一致的标准来确定差异表达基因。本研究成功筛选出干扰效果良好的两条序列。芯片经扫描后分析杂交结果，EGFR、VEGF、bcl-2三个基因表达下调，TRAIL基因表达上调。认为端粒酶逆转录酶除了具有延长端粒功能外，还参与调控若干与细胞增殖、凋亡相关的基因表达。,立项依据,电子荧光显微镜下，白色的为端粒,端粒(tolemere)是染色体末端的DNA重复序列。端粒的作用是保持染色体的完整性，还在维持染色体结构稳定，染色体在细胞中的定位和引起细胞衰老等方面起着重要作用。,端粒酶：一种反转录酶，由蛋白质和RNA两部分组成核糖蛋白复合体，其中RNA是一段模板序列，指导合成端粒DNA的重复序列片段。 端粒酶是由人端粒RNA（human telomerase RNA，hTR）、端粒相关蛋白1（telomerase related protein 1，TLP1/TP1）和人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）三部分组成，其中hTERT又称端粒酶催化亚基，是端粒酶活性的核心限制因素，对端粒酶的激活起决定作用。,通过研究端粒酶逆转录酶（hTRET）基因沉默对HeLa细胞增殖，凋亡的影响，可以让我们更多了解端粒酶的作用，因其对肿瘤细胞的调控作用，端粒酶拥有相当良好的发展前景和研究价值。,研究目标,实验原理,hTERT的表达水平与端粒酶活性呈正相关，本实验利用RNA干扰技术对hTERT进行短效抑制，导致若干与肿瘤细胞增殖、凋亡密切相关的基因的表达变化，来探寻hTERT对其的影响。 构建针对hTERT基因的siRNA真核表达载体pLXSN-EGFP-U6-siTERT,制备靶向hTERT的重组逆转录病毒;用重组逆转录病毒感染hela细胞,以TRAP法检测端粒酶活性变化;流式细胞仅检测细胞凋亡率;MTT法检测肿瘤细胞生长抑制情况.,可行性分析,本实验采用的方法均为较常见的实验技术，操作也较为简便，只是时间消耗过长，对实验室温度等条件要求较高，实验时注意对酶活性的保护，应该可以得到预期的结果。,实验方法,1.hTERT的设计与合成 2.细胞转染(图示） 3.有效序列的筛选 （1）实验分组 （2）RT-PCR检测,4.Western blot 检测,裂解细胞提取蛋白。用酚试剂法进行定量后，将含有等量蛋白的细胞裂解液用样品缓冲液溶解，置于SDSPAGE(分离胶8、浓缩胶5)电泳分离，用半干转方法转移至硝酸纤维素膜，室温下封闭，过夜；加入兔抗hTERT抗体，孵育2 h，02 molL NaOH洗膜去除膜上抗体，加碱性磷酸酶标记的二抗，孵育2 h，用碱磷酶显色液显色后成像。,5.芯片杂交检测 实验分为转染组和空白对照 组，选取干扰效果好的两条序列作为转染组，分别与 空白对照组进行基因差异表达分析,预期实验结果,靶向hTERT的siRNA转染后可以显著降低HeLa细胞侵袭能力,抑制增殖,诱导细胞凋亡的发生。 本研究利用RNA干扰技术对lTERT进行短效抑制，导致若干与肿瘤细胞增殖、凋亡密切相关基因的表达变化，说明端粒酶的功能不仅仅是延长端粒，这些基因的表达改变很可能是抑制hTERT治疗肿瘤的非端粒依赖的机制之一。,创新性,端粒酶相对于其他研究方向更加新颖，2009年，Elizabeth Blackburn因在端粒研究方面的杰出贡献而被授予诺贝尔生理学奖。,经费预算,由于该实验大部分所需器材和试剂在市场都容易采购,所以费用不会过高,初步估计在两千元左右,参考文献,1.周雪峰 王建军 王家顺 人端粒酶逆转录酶基因沉默对肺腺癌细胞侵袭、增殖、凋亡的影响。 实用医学杂志 2009年第一期 2.Fleisig H B.Wong J M Telomerase as a clinical target:Current strategies and potential applications 外文期刊 2007(01) Robert H V Prospects and challen