细胞生物学--第七章线粒体和过氧化物酶体.ppt

1,线粒体和过氧化物酶体,Chapter 7,2,7.1 线粒体形态 7.2 线粒体结构与化学组成 7.3 导向信号与线粒体蛋白定位 7.4 线粒体功能:氧化磷酸化 7.5 线粒体遗传、增殖和起源 7.6 过氧化物酶体,纲 要,3, 线粒体的发现与功能研究 1850年，德国生物学家Rudolph Klliker第一系统的研究了线粒体。(肌细胞) 1900年，Leonor Michaelis 氧化还原反应 1943年，Arbert Claude 采用盐法分离技术分离到线粒体 1948年George Hogeboom等采用蔗糖介质分离有活性的线粒体 能量转换的部位 逐步证明了线粒体具有Krebs循环、电子传递、氧化磷酸化的作用，从而证明了线粒体是真核生物进行能量转换的主要部位。,7.1 线粒体的形态结构,4,线状,颗粒状,光镜下形态,大小,直径约0.51m 长度在1.53 m,故名线粒体,7.1 线粒体的形态结构,5,7.1 线粒体的形态结构,6,7.2 线粒体结构与化学组成,7,将线粒体放在100 mM蔗糖溶液中，蔗糖穿过外膜进入线粒体的膜间间隙；然后将线粒体取出测定线粒体内部蔗糖的平均浓度，结果只有50 mM， 比环境中蔗糖的浓度低。据此推测:线粒体外膜对蔗糖是通透的，而内膜对蔗糖是不通透的,线粒体膜通透性实验,8,首先将线粒体置于低渗溶液中使外膜破裂，此时线粒体内膜和基质(线粒体质)仍结合在一起，通过离心可将线粒体质分离。用去垢剂Lubrol处理线粒体质，破坏线粒体内膜，释放线粒体基质，破裂的内膜重新闭合形成小泡，其表面有F1颗粒。,线粒体组分的分离,9,标志酶:单胺氧化酶; 外膜含有较大的通道蛋白:孔蛋白;,外膜(outer menbrane),革兰氏阴性细菌外膜中的孔蛋白,折叠,10,线粒体进行电子传递和氧化磷酸化的部位，通透性差; 含有大量的心磷脂(cardiolipin)， 心磷脂与离子的不可渗透性有关; 内膜的标志酶:细胞色素氧化酶; 按作用分3类酶 运输酶类 合成酶类 电子传递和ATP合成的酶类,内膜(inner membrane),11,标志酶:腺苷酸激酶 功能:建立电化学梯度 线粒体基质(matrix) 标志酶:苹果酸脱氢酶 功能:进行氧化反应， 主要是三羧酸循环,膜间隙(intermenbrane space),12,线粒体膜的运输系统,13,线粒体的钙调节作用,系统1是由膜动力势引起的Ca2+离子流向线粒体基质; 系统2是通过与Na+离子的交换将Ca2+离子输出到胞质溶胶。,14,线粒体各部分的蛋白质来自何方? 定位机理如何?,7.3 前导肽与线粒体蛋白定位,15,蛋白质的两种运输方式 翻译后转运 游离核糖体上合成的蛋白质释放到胞质溶胶后被运送到不同的部位， 即先合成，后运输。在合成释放之后需要自己寻找目的地，又称为蛋白质寻靶。 共翻译转运 膜结合核糖体上合成的蛋白质通过定位信号，一边翻译，一边进入内质网，在翻译的同时进行转运定位， 通过信号肽，经过连续的膜系统转运分选才能到达最终的目的地，称为蛋白质分选。,7.3.1 蛋白质寻靶与分选,16,细胞质核糖体的蛋白质合成与去向,分秘泡,共翻译转运,翻译后转运,17,游离核糖体合成蛋白质的去向,18,前导肽(leading peptide) 将游离核糖体上合成的蛋白质的N-端信号称为导向信号，或导向序列，由于这一段序列是氨基酸组成的肽，所以又称为转运肽。 信号肽(signal peptide) 将膜结合核糖体上合成的蛋白质的N-端的序列称为信号序列，将组成该序列的肽称为信号肽。,前导肽与信号肽,19,长约20-80个氨基酸，通常带正电荷的碱性氨基酸(特别是精氨酸和赖氨酸)含量较为丰富; 序列中不含有或基本不含有带负电荷的酸性氨基酸，并且有形成两性(既亲水又疏水)螺旋的倾向。 有利于穿过线粒体的双层膜； 需要消耗能量; 需要分子伴侣。,线粒体前导肽的性质,20,前导肽的特异性 具有细胞结构的特异性 前导肽的不同片段含有不同的信息（双导向序列）,21,两个导向序列，位于N端最前面的为基质导向序列，其后还有第二个导向序列，即膜间隙导向序列，功能是将蛋白质定位于内膜或膜间隙,双导向序列,基质导向序列,膜间隙导向序列,22,如何证明前导肽引导 蛋白质进入线粒体? P274,23,分离线粒体 与具有线粒体基质定位信号的前体蛋白温育 胰蛋白酶处理,实验设计,24,线粒体蛋白定位的实验,25,7.3.2 线粒体蛋白定位,26,线粒体基质蛋白定位 线粒体膜间间隙蛋白的定位 需要两个前导肽、两种方式: 保守性寻靶 非保守性寻靶 线粒体内膜蛋白的定位 线粒体外膜蛋白的定位,27,线粒体基质蛋白定位,前导肽,前导肽酶,28,然后通过N-端的前导肽同线粒体外膜上的受体蛋白识别， 并在受体(或附近)的内外膜接触点(contact site)处利用ATP水解产生的能量进入转运蛋白的运输通道， 然后由电化学梯度驱动穿过内膜，进入线粒体基质 在基质中， 由线粒体分子伴侣Hsp70(mHsp70)继续维持前体蛋白的解折叠状态。 接着在Hsp60的帮助下， 进行正确折叠， 最后由前导肽酶切除导向序列，成为成熟的线粒体基质蛋白。,前体蛋白在游离核糖体合成释放之后，在细胞质分子伴侣 Hsp70的帮助下解折叠，,29,线粒体膜间间隙蛋白保守性寻靶,基质导向序列,膜间隙导向序列,前导肽酶,30,定位需要两个导向序列，基质导向序列和膜间隙导向序列。这类蛋白有两种转运定位方式。 保守性寻靶 前体蛋白在N-端的基质导向序列引导下采用与线粒体基质蛋白同样的运输方式，将前体蛋白转运到线粒体基质， 在基质中由前导肽酶切除基质导向序列后， 膜间隙导向序列就成了N端的导向序列， 它能够识别内膜的受体和转运通道蛋白，引导蛋白质穿过内膜，进入线粒体膜间隙，然后由线粒体膜间隙中的前导肽酶将膜间隙导向序列切除。,线粒体膜间间隙蛋白的转运,31,膜间隙导向序列,基质导向序列,前导肽酶,线粒体膜间间隙蛋白非保守性寻靶,膜间隙导向序列作为停止转运序列锚定在内膜上,32,在线粒体基质导向序列的引导下，通过线粒体的外膜和内膜，但是疏水的膜间隙导向序列作为停止转运序列锚定在内膜上，从而阻止了蛋白质的C-末端穿过内膜进入线粒体基质； 然后通过蛋白质的扩散作用，锚定在内膜上的蛋白逐渐离开转运通道，最后在前导肽酶的作用下，将膜间隙导向序列切除，蛋白质释放到膜间隙。, 非保守性寻靶,33,只需一个前导肽，引导外膜和内膜蛋白穿膜，前导肽后面一段疏水的停止转运序列阻止转运蛋白进一步穿膜， 外膜蛋白：停止转运序列与外膜转运酶结合 P274 内膜蛋白：停止转运序列与内膜转运酶结合,线粒体外膜、内膜蛋白的定位,34,7.4 线粒体的功能:氧化磷酸化作用,7.4.1 真核细胞中的氧化作用 糖的有氧氧化(细胞氧化或生物氧化): 葡萄糖(或糖原)在正常有氧的条件下， 氧化后产生CO2 和水， 分为三个阶段 糖氧化成丙酮酸 丙酮酸脱羧生成乙酰CoA 乙酰CoA进入三羧酸循环彻底氧化,35,糖酵解(glycolysis)： 细胞质中的葡萄糖(或糖原)在一系列酶的催化下生成丙酮酸的过程。 细胞质中 不耗氧,葡萄糖酵解生成丙酮酸,36,糖的酵解与氧化,糖酵解,丙酮酸,37,丙酮酸跨膜进入线粒体基质； 在丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase)作用下氧化成乙酰辅酶A。,线粒体基质中乙酰辅酶A的生成,38,乙酰辅酶A的生成,丙酮酸,丙酮酸脱氢酶,39,必要时也会利用脂肪: 脂肪被水解生成脂肪酸; 脂肪酸能够进入线粒体基质，通过氧化途径(-oxidation pathway)循环氧化生成乙酰辅酶A。,生物需要能量时首先利用多糖;,40,氧化,41,(tricarboxylic acid cycle， TCA) 又叫Krebs循环、柠檬酸循环。,三羧酸循环,42,三羧酸循环,43,7.4.2 呼吸链与电子传递,线粒体能量转换策略 三羧酸循环中的能量转换 NAD+ NADH FAD+ FADH2 NADH和FADH2必须被氧化才能维持三羧酸循环 NADH + 1/2 O2 NAD+ + 能量 FADH2 + 1/2 O2 FAD+ + 能量 NADH和FADH2被氧化时释放的H+、电子和能量如何安置?,44,几种辅酶的结构,45,在电子传递过程中与释放的电子结合并将电子传递下去的物质 电子载体类型 除了辅酶Q以外，接受和提供电子的氧化还原中心都是与蛋白相连的辅基, 电子载体(electron carriers),46,黄素蛋白 一条多肽结合1个辅基组成的酶类，结合的辅基可以是FAD或FMN 两个质子和电子 细胞色素 血红素辅基 Fe3+和 Fe2+ 单个的电子 铁硫蛋白 细胞色素类蛋白 铁-硫中心 Fe3+和 Fe2+ 泛醌或称辅酶Q 一种脂溶性的分子 两个电子和质子 部分还原的称为半醌，完全还原的称为全醌,47,泛醌的氧化与还原,48,又称电子传递链，是线粒体内膜上的一组酶的复合体 功能 电子传递 H+的传递 利用氧，产生水和ATP,呼吸链(respiratory chain),49,电子传递链,50,又称NADH 脱氢酶或NADH-CoQ 还原酶复合物， 功能：催化一对电子从NADH传递给CoQ，伴随着4个质子被传递到膜间隙。 复合物 (Complex ) 又称为琥珀酸脱氢酶或琥珀酸-CoQ 酶复合物， 功能：催化电子从琥珀酸传递给辅酶Q， 不伴随氢的传递。,复合物I (Complex I),51,又称CoQH2-细胞色素c 还原酶复合物， 功能：催化一对电子从CoQ传递给细胞色素c ， 同时传递4个H+到膜间隙。 复合物 Complex 又称细胞色素c氧化酶 功能：将电子从细胞色素c传递给O2 分子，每传递一对电子，要从线粒体基质中摄取4个质子，其中2个质子用于水的形成，另2个质子被跨膜转运到膜间隙。,复合物 Complex (Cytochrome bcl),52,电子传递链,53,主次电子传递链,由于线粒体中需要经呼吸链氧化和电子传递的主要是NADH，而FADH2较少，可将呼吸链分为主、次呼吸链。 主呼吸链 复合物、和构成主呼吸链，从NADH来的电子依次经过这三个复合物， 进行传递。 次呼吸链 复合物、构成次呼吸链，来自FADH2的电子不经过。,54,线粒体内膜主次呼吸链,55, 递氢体 组成呼吸链的成员中能够传递氢质子的复合物称为递氢体。 质子从线粒体基质跨膜传递到线粒体膜间隙是一种耗能的过程， 递氢体通过对质子的跨膜传递，将NADH和FADH2在氧化过程中释放出来的自由能转变成势能， 这种势能可进一步用于ATP 的合成, 递氢体与电化学梯度的建立,56,质子跨膜转运使得膜间隙积累了大量的质子，建立了质子梯度。 使内膜两侧发生两个显著的变化 线粒体膜间隙产生大量的正电荷，而线粒体基质产生大量的负电荷，使内膜两侧形成电位差； 另外两侧氢离子浓度的不同因而产生pH梯度(pH)， 这两种梯度合称为电化学梯度(electrochemical gradient)。, 电化学梯度(electrochemical gradient),57,7.4.3 电子传递与氧化磷酸化,氧化磷酸化 活细胞中伴随着呼吸链的氧化作用所发生的能量转换和ATP的形成过程。,58,电化学梯度 质子动势proton-motive force 合适的条件下 可以变成化学能,线粒体内膜电化学梯度的建立,59,质子动势的建立,60,通过线粒体内膜重建实验证明位于内膜上的F1-F0颗粒是呼吸链中ATP合成的部位。,F1-F0 复合物是ATP合成部位,61,线粒体内膜重建实验,62,酶活性:两种酶活性 ATP水解酶的活性 ATP合成酶的活性 故F0-F1颗粒又称为ATP合酶(ATP synthase )。, F0-F1颗粒的结构和功能,63,头部:即F1，由5种多肽（33）组成九聚体，含有3个催化ATP合成的位点，每个亚基一个。 柄部:由F1的亚基和亚基构成，亚基穿过头部作为头部旋转的轴。 膜部:即F0，由3种不同的亚基组成的15聚体(1a2b12c)。 c亚基: b亚基: a亚基:,结构,64,Structure of ATP synthase,65,英国生物化学家P.Mitchell 1961年提出了化学渗透假说(chemiosomotic compling hypothesis)解释氧化磷酸化的偶联机理。 在电子传递过程中，伴随着质子从线粒体内膜的里层向外层转移，形成跨膜的氢离子梯度，这种势能驱动了氧化磷酸化反应(提供了动力)，合成了ATP。,氧化磷酸化机理,66,化学渗透学说,67,7.5 线粒体的遗传、增殖和起源,线粒体遗传 线粒体是一种半自主性的细胞器，它除了有自己的遗传物质线粒体DNA外，还有蛋白质合成系统（mRNA、rRNA、tRNA）和线粒体核糖体等。 线粒体中的蛋白质只有少数几种是线粒体基因编码的，大多数线粒体蛋白质还是由核基因编码。,68, 线粒体的基因组 线粒体DNA（mt DNA）是双链环状分子， mtDNA通常与线粒体内膜结合在一起。 线粒体的复制期 主要在细胞周期的S期和G2期，与细胞周期同步。,69,线粒体密码 基本上属于原核类型 mRNA的转录和翻译是在同一时间和地点进行、 蛋白质合成的起始tRNA与原核生物的相同 蛋白质合成对药物的敏感性与细菌一样。如氯霉素可抑制线粒体的蛋白质合成，而不抑制细胞质的蛋白质合成； 放线菌酮可抑制细胞质蛋白质的合成而不抑制线粒体蛋白质的合成。,70,线粒体增殖的方式 线粒体通过分裂进行增殖。,71,线粒体起源 内共生学说（endosymbiont hypothesis） 认为线粒体来源于细菌，即细菌被真核生物吞噬后，在长期的共生过程中，通过演变，形成了线粒体。 非内共生学说 又称细胞内分化学说。认为线粒体的发生是质膜内陷的结果。,72,73,7.6 过氧化物酶体 peroxisome,过氧化物酶体是一层的单位膜包裹的囊泡，又称微体 直径约为0.11