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细胞染色专题之一：台盼蓝 台盼蓝（Trypan Blue，也称Direct blue 14）：一种死细胞染色用色素化学名：3,3-3,3-Dimethyl(1,1-biphenyl)-4,4-diylbis(azo)bis(5-amino-4-hydroxy-2,7-naphthalenedisulfonic acid), tetrasodium salt3,3-3,3-二甲基-(1,1-二苯基)-4,4-二基双(偶氮)-双(5-氨基-4-羟基-2,7-萘二磺酸)，四钠盐分子式：C34H24N6Na4O14S4分子量：960.81CAS Number： 72-57-1外观：黑褐色结晶粉末摩尔吸光度：69,000(在606nm附近)染色原理：细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内。故可以鉴别死细胞与活细胞。严格来说，台盼蓝染色检测的是细胞膜的完整性， 通常认为细胞膜丧失完整性，即可认为细胞已经死亡。这被称为染料排除测试（dye exclusion），Erythrosin B(红色)、negrosine、eosin Y、AO和EB也用于此目的。通过显微镜很容易就能识别出死亡的被台盼蓝染色的细胞，并可使用细胞计数器进行计数。溶于水，可以配制成10mg/ml的水溶液，水溶液呈深蓝色。台盼蓝主要用来鉴定原代培养细胞时,细胞分离后的存活情况，用0.4%台盼蓝直接染色5-10分钟，在显微镜下观察即可。应用于细胞凋亡：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。尽管在凋亡的早期到中期检测是很困难的，此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。储存条件：常温保存注意事项：1. 台盼蓝对人体有毒2. 台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数。3. 台盼蓝染色法对于悬浮细胞来说，还比较方便，对贴壁细胞来说，较为繁琐。因为要消化，有时，96孔板不一定能消化干净。而且，该法是测定细胞浓度的方法，与细胞悬液的体积有关，加入的胰蛋白酶或1640要计入终体积。可以说，该法相对准确，可能有一些人为因素的干扰。细胞染色专题之二：美蓝 美蓝英文名：Methylene blue，Swiss blue中文名：亚甲基蓝、次甲基蓝、品蓝、美蓝、亚甲蓝、四甲基蓝、盐基湖蓝、碱性亚甲天蓝等。分子式：C16H18ClN3S分子量：319.85 g/molCAS Number：61-73-4EINECS Number： 200-515-2熔点：100 沸点：分解吸收峰：668nm和609nm。染色原理：美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能 使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，而对代谢作用微弱或死细胞，无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，不仅用此法可观察酵母 细胞形态，也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。细胞染色专题之三：吖啶橙吖啶橙：N,N,N,N-tetramethylacridine-3,6-diamine中文名：3,6-双(二甲基氨基)吖啶英文名：Acridine Orange（ AO），Euchrysine，3,6-Acridinediamine，Waxoline Orange A，Acridine Orange Base，Solvent Orange 15，Rhoduline Orange，Rhoduline Orange N，Acridine Orange NO，Rhoduline Orange NO，Basic Orange分子式：C17H19N3分子量：265.35 g/molCAS number：10127-02-3外观：橙色、红棕色粉末染色原理：吖啶橙（AO）与双链DNA形成发绿色荧光的复合物。AO还可与单链DAN或RNA形成发红色荧光 的复合物。一个AO分子嵌入双链DNA的三个碱基对并发出最大波长为526nm（激发502nm）的绿色荧光。一个AO分子与单链DNA或RNA的一个磷 酸基相互作用形成聚集或堆叠的结构，此结构发出最大波长为650nm（激发460nm）的红色荧光。因此，AO用于被利用来检测双链DNA和单链DNA或 RNA。它使得用氩激光激发器或流式细胞仪同时测定DNA和RNA成为可能。光谱数据：与DNA作用时和荧光素相似，激发最大波长502nm，发射最大525nm（绿光）。于RNA作用时，激发最大波长移动到460nm（蓝光），发射最大移动到650nm（红光）。染色程序：1. 用PBS或合适缓冲液制备10-50M AO溶液。a)2. 将1/10细胞培养基体积的AO溶液加入细胞培养基中。b)3. 37下孵育细胞10-20分钟。4. 用PBS或合适缓冲液洗涤细胞2次。5. 用带有500nm激发和530nm发射滤光片的荧光显微镜观察细胞。a) 由于AO可能具有致癌性，因此操作过程中须格外小心。b) 可以用1/10浓度的AO缓冲液代替培养基。储存条件：避光, 冷藏保存细胞染色专题之四：碘化丙啶 碘化丙啶英文名：Propidium iodide, Propidium diiodide; PI分子式：C27H34I2N4分子量：668.39外观：红棕色粉末应用：DNA染色染色原理：碘化丙啶(PI)是一种溴化乙啶的类似物，它在嵌入双链DNA后释放红色荧光。尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。PI经常被用 来与Calcein-AM或者FDA等荧光化合物一起使用，能同时对活细胞和死细胞染色。光谱性质：PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535nm和 615nm。染色过程：1 用PBS或适当的缓冲液制备1050M的PI溶液。a)2 将1/10培养基体积的PI溶液加入到细胞培养基中。b)3 在37培养细胞10-20分钟。4 用PBS或合适的缓冲液洗涤细胞两次。5 用535nm激发波长，615nm发射波长的滤光器的荧光显微镜观察细胞。a) 由于PI可能具有致癌性，请小心操作。b) 也可以用1/10浓度的PI缓冲液代替培养基。保存条件：4避光保存对人体有刺激性，请注意适当防护细胞染色专题之五：罗丹明123罗丹明123：Rhodamine 123分子式：C21H17ClN2O3分子量：381外观：橙红色、红棕色固体/粉末溶解性：可溶于DMSOCAS Number：62669-70-9染色原理： Rh 123是一种细胞通透性的、阳离子的荧光探针，容易被有活性的线粒体摄取，没有细胞毒性。Rh123透过细胞膜在活细胞的线粒体内聚集，发出黄绿色荧光，可用于对许多种细胞进行染色，包括植物细胞和细菌。由于细胞内ATP的量与Rh123的荧光强度之间有相关性，此化合物被应用于检测细胞内的ATP。Rh123还用于癌症研究。光谱性质：lexl em (MeOH) = 505nm534nm. e (505 nm, MeOH) = 97,000.染色步骤：1. 将0.4mg Rh123溶解到1ml DMSO中制备成1mM Rh123-DMSO溶液。2. 用载玻片准备细胞。细胞数目应为510e4 - 510e5个/ml。3. 孵育该载玻片，用PBS或Hanks液洗涤细胞。4. 用培养基稀释1mM Rh123溶液以制备1-20M Rh123缓冲液。5. 将Rh123缓冲液a) 加入载玻片并在37下孵育30分钟至1小时。6. 去除Rh123缓冲液并用培养基洗涤细胞。b)7. 用带有荧光素滤光片的荧光显微镜观察细胞。a) 加入细胞前将Rh123缓冲液放在37下孵育。b) 洗涤细胞后为了固定，加入10福尔马林缓冲液并孵育15-20分钟，接着用PBS洗涤。储存条件：避光冷藏保存细胞染色专题之六：溴乙锭溴乙锭：Ethidium bromide化学名：溴化3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基啡啶英文名：2,7-Diamino-10-ethyl-6-phenylphenanthridinium bromide，2,7-Diamino-10-ethyl-9-phenylphenanthridinium bromide，3,8-Diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridinium bromide，3,8-Diamino-5-ethyl-6-phenylphenanthridinium bromide，Homidium bromide，EB，EtBr别名：胡溴胺;溴乙胺菲啶;溴乙菲啶分子式：C21H20BrN3分子量：394.31 g/molCAS number：1239-45-8熔点：260 - 262 （from wiki）性质：从酒精中结晶的是具苦味的深红晶体，熔点238240；20时溶于20份水和750份氯仿。染色原理： EB不能穿过活细胞的细胞膜，然而可以通过死细胞破损的细胞膜而对细胞核DNA染色。EB含有一个可以嵌入的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，由于EB-DNA复合物的荧光产率远大于未结合染料的荧光产 率，所以当电泳凝胶中含有游离EB时，也可检测出少量DNA。它是一种高灵敏的荧光试剂，也是一种重要的荧光染料，常用于检测DNA和RNA。EB与DNA结合后 抑制DNA的复制和转录。光谱性质： EB-DNA复合物的激发波长和发射波长分别为518nm和605nm。染色过程：1. 用PBS或合适的缓冲液制备10-50M EB溶液。a)2. 将1/10培养基体积的EB溶液加入细胞培养基中。b)3. 37下孵育细胞10-20分钟。4. 用PBS或合适的缓冲液洗涤细胞两次。5. 用带有515nm激发波长和600nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。a) 由于EB可能有致癌性，操作时须十分小心。b) 可以用1/10浓度的EB缓冲液代替培养基。储存条件：避光, 冷冻保存细胞染色专题之七：曙红Y曙红： Eosin Y中文名：水溶伊红；四溴荧光黄；朝红；四溴荧光素钠；曙红钠盐；曙红,水溶性；黄光曙红英文名： Eosine Yellowish，Bromoeosine，TetrabromofluoresceinC.I. name： Acid red 87分子式： C20H6O5Br4Na2分子量： 691.9性质：以AgNO3滴定Br-，I-，SCN-等时用作吸附指示剂。CAS Number: 17372-87-1MDL number：MFCD00005040 Colour Index Number：45380 光谱性质：最大吸收524.8 nm；最大激发490 nm染色原理： Eosin Y为酸性染料，将胞质染成粉红色(嗜酸性)，是组织和细胞化学常用染色试剂之一，常与苏木精（hematoxylin，为碱性染料，将核染成紫蓝色(嗜碱性)）联合使用（HE染色法）。在免疫组织化学实验中，常作为衬染试剂以便于组织和细胞结构的观察。存储条件：室温避光保存细胞染色专题之八：苏木精苏木精 Hematoxylin中文名：苏木色精，苏木色素，苏木精，苏木素，洋苏木素英文名：Hematoxyli7,11b-Dihydrobenzindeno1,2-dpyran-3,4,6a,9,10(6H)-pentol，Natural Black分子式： C16H14O6分子量： 302.28性质：无色棱形晶体，遇光变红； 熔点100-120C；难溶于冷水和乙醚，易溶于热水和热乙醇，溶于碱、氨和硼砂的溶液。含有3分子结晶水，在100120溶于本身的结晶水中。在水溶液中，特别是在碱溶液中易被空气氧化成红棕色的氧化苏木精。C.I. name： Natural blackC.I. number： 75290CAS number： 517-28-2EINECS number： 208-237-3Beilstein Registry Number：91400EG/EC Number：2082373 MDL number：MFCD00078111 染色原理：苏木精是染细胞核的优良材料，他能把细胞中不同的结构分化出各种不同的颜色。分化时组织所染的颜 色因处理的情况而异，用酸性溶液（如盐酸酒精）分化后呈红色，水洗后仍恢复青蓝色，用碱性溶液（如氨水）分化后呈蓝色，水洗后呈蓝黑色。用途：一种天然媒介染料。用于蚕丝、毛皮和皮革的染色以及棉布的印花，用不同的媒染剂可得到蓝色或黑色。与重铬盐、铁盐、亚铁盐、铝盐和锡盐等一起可制成各种色淀。在分析化学中用于比色分析、显微镜分析，并用作pH值指示剂，变色范围5.06.0，由黄色变紫色。作为天然色素,多用于食品工业、日化工 业、皮革及织物染色等,病理实验中可作为细胞组织切片的染色剂.苏木水提物最早被发现有抗癌作用,随后的研究证明了其抗癌活性物质就是苏木精细胞染色专题之九：孔雀绿 孔雀绿(Malachite Green)中文名：孔雀绿，孔雀石绿，碱性绿，盐基品绿英文名：Malachite green，aniline green, basic green 4, diamond green B, victoria green B，4-(4-dimethylaminophenyl)-phenyl-methyl-N,N-dimethyl-aniline)分子式：C23H25ClN2 (chloride)分子量：364.911 g/mol (chloride)性质：孔雀绿是有毒的三苯甲烷类化学物，既是染料，也是杀菌剂，可致癌。孔雀石绿一般有二种。第一种是天然的矿石，为水合碱式碳酸铜Cu(OH)2 CO3或2CUOCO2H2O，呈翠绿或草绿色的块石，含71.9%CuO、19.9% CO2、比重3.9-4.03、能溶于酸类。主要用于铜的提炼和供作颜料，但并不用于水产养殖业。第二种是孔雀石绿染料 （Malachite Green Dyestuff），又有Anillne Green、China Green、Victorla Green等多个名称，是人工合成的有机化合物。它的生产是由1分子（mol）的苯甲醛Benzaldehyde和2分子的二甲苯胺Dimethyl aniline在浓盐酸混和下，加热缩合成隐色素碱Leuco base，在酸性下加过氧化铅使其氧化，并在(酸？碱？)性液中沉淀出色素碱，它是属于三苯基甲烷型的绿色染料Tryphenyl Methane Dyestuffs。绿色闪光结晶，溶于水、酒精显蓝绿色；遇硫酸呈黄色，稀释后呈暗橙色；水溶液加氢氧化钠形成微带绿光的白色沉淀。PH值在0.132.0变色为黄浅蓝绿，PH值在11.513.2变色为蓝绿无色。CAS number：569-64-2光谱性质：最大吸收616.5nm染色原理：孔雀石绿可用作生物染色剂，把细胞或细胞组织染成蓝绿色，方便在显微镜下研究。孔雀石绿也用作丝绸、皮革和纸张的染料。虽然称作孔雀石绿，但其实它不含有孔雀石的成份，只是两者颜色相似而已。用于芽孢染色的步骤：取一干净载片按无菌法取巨大芽孢杆菌菌体少许制成涂片，风干固定后，在涂菌处滴加法7.6%的孔雀绿饱和水溶液，染色10分钟后， 用水冲洗，再用0.5%蕃红花红液染色彩1分钟，水洗，风干后镜检。芽孢 被染成绿色，营养体呈红色。细胞染色专题之十：DAPIDAPI 中文名：4，6-联脒-2-苯基吲哚(?)英文名：4,6-diamidino-2-phenylindole，2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine，DAPI dihydrochloride分子式：C16H15N5分子量：277.324CAS number：28718-90-3光谱性质：与双链DNA结合时最大吸收/最大发射为358 nm/461 nm；与RNA结合时，最大发射移动到400 nm左右。染色原理：DAPI 为一种荧光染料，可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光，和EB相比，对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍。显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜观察细胞标记的效率高(几乎为100 %) ，且对活细胞无毒副作用。DAPI染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。细胞经热激处理后用DAPI染色3分钟，在荧光显微镜下可以看到到细胞核的形态变化。a、 正常的烟草细胞核：核形完整，染色质均匀。 b、 染色质固缩，向外周聚集，形成周边化。 c、 染色质进一步固缩，形成很多颗粒物质。d、 细胞核破裂形成碎片，核解体。染色步骤：在细胞移植前，将DAPI 以一定的浓度加入培养基中，与细胞共同孵育过夜，用PBS 缓冲液漂洗至少6 次以洗掉未结合的DAPI，在用酶消化后离心收集细胞，加入DMEM 培养基制成细胞悬液以备用。存储条件：-20避光保存(?4C?)注意事项：1、DAPI强烈致癌，操作时要戴上手套。2、贮存液用70%酒精配制，浓度100 g/ml，可用黑纸包住，长期冻存。使用液按1:1000用PBS稀释，最终浓度100 ng/ml。3、DAPI是非常优秀的DNA染料，固定过和没有固定过的活细胞均可用DAPI染色。细胞染色专题之十一：结晶紫 结晶紫（crystal violet）中文名：(结)晶紫，氯化甲基玫瑰苯胺，结晶紫，龙胆紫，甲基青莲，碱性紫，甲紫，其溶液俗称“紫药水”英文名：crystal violet，Methyl violet 2B，Methyl violet，methylrosaniline chloride，Gentian Violet，Bas